m
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1998, том 24, № 6, с. 437^45
УДК 582.273-119.2:547.458.7
ПОЛИСАХАРИДЫ ВОДОРОСЛЕЙ 53*. БУРАЯ ВОДОРОСЛЬ Laminaria saccharina (L.) Lam. КАК ИСТОЧНИК ФУКОИДАНА
© 1998 г. А. И. Усов#, Г. П. Смирнова, М. И. Бнлан, А. С. Шашкой
Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 117913, Москва, ГС 11-1, Ленинский просп., 47 Поступила в редакцию 10.12.97 г. Принята к печати 22.12.97 г.
Бурая водоросль Laminaria saccharina исследована как потенциальный источник фукоидана. Показано, что два образца водоросли, собранные в Белом и Баренцевом морях, имеют качественно идентичный полисахаридный состав и существенно различаются только содержанием резервных углеводов - манкита и ламинарана. Полисахариды выделены фракционной экстракцией, и препараты ламинарана и альгипата охарактеризованы спектрами 1:,С-ЯМР. В составе фукоидана в качестве главных компонентов найдены L-фукоза и сульфат, а в качестве минорных - галактоза, ксилоза и i .аюкуроновая кислота. Эффективное десульфатирование фукоидана достигнуто путем сольволиза в смеси DMSO-метанол. Строение десульфатированного полисахарида и исходного фукоидана изучено методами метилирования, периодатного окисления и спектроскопии ЯМ Р. Установлено, что фукоидан содержит главную цепь из 1 —— 3-связанных остатков a-L-фукопиранозы с сульфатными группами в положении 4 и отдельными разветвлениями в положении 2. Фукоидан проявляет ан-тикоагулянтные свойства и является мощным ингибитором взаимодействия Р-селектина с его углеводными лигандами.
Ключевые слова: бурые водоросли; фукоидан; ламинаран; альгинат; Laminaria saccharina.
ВВЕДЕНИЕ
Фукоиданами назынают полисахариды, построенные преимущественно из остатков «-¿-фу-копиранозы и сульфата. Такие биополимеры содержатся в бурых водорослях [2-4], а родственные им вещества найдены в морских беспозвоночных, относящихся к типу иглокожих [5-8]. Фукоиданы проявляют многочисленные важные биологические эффекты в клетках млекопитающих, связанные преимущественно с модификацией свойств клеточной поверхности, и могут найти применение при разработке новых медицинских препаратов противовирусного, противовоспалительного, противоопухолевого, им» муномодулирующего, контрацептивного и анти-коагулянтного действия [9, 10]. Биологическую активность фукоиданов связывают в первую очередь с высокой степенью сульфатирования, хотя очевидно, что тонкие детали структуры и моле-кулярно-массовое распределение также должны
s Сообщение 52 см. [1].
# Автор для переписки (тел.: 137-67-91; факс: 135-53-28; e-mail: usov@ioc.ac.ru).
существенно влиять на биологические свойства препаратов [9].
Разные виды бурых водорослей часто сильно различаются по содержанию и составу фукоиданов [J 1,12]. Наиболее богатым источником этих полимеров являются представители порядка Fu-cales. Один из видов фукусовых, Fucus vesiculosus, служит сырьем для производства коммерческого препарата фирмы "Sigma". На полисахариде из этой водоросли были установлены и главные структурные характеристики фукоиданов [2-4]. В течение длительного времени считалось, что углеводные цепи этого полисахарида содержат преимущественно связи I —- 2, а сульфат расположен главным образом в положении 4 остатков tt-L-фукопиранозы; в меньшей степепи в молекулах обнаруживались связи других типов и разветвления. Пересмотр этой структуры в недавней работе [10] привел авторов к выводу, что главная цепь полисахарида содержит связи 1 —- 3, разветвления присоединены к пей в положение 2, а сульфатные группы занимают почти исключительно положения 4 остатков фукозы. Более разветвленная структура с неупорядоченным распределением сульфата предложена для фукоидана из Ее kl о nia киготе [13, 14]. В целом можно сказать, что отсутствие видимых признаков регулярности в построении полимерных молекул де-
Таблица 1, Углеводный состав биомассы двух образцов L. saccharina*
Образец Содержание, %
Маннит Фу коз а Ксилоза Манноза Глюкоза Галактоза
I 17.6 4.6 0.6 2.2 16.8 1.7
II 8.2 4.1 0.4 1.3 1.2 0.9
* 11ейтральные моносахариды определяли в гидролизате биомассы водоросли, полученной после предварительной экстракции и определения маннита по методике [20].
лает в высшей степени затруднительной характеристику общей структуры этих биополимеров. Наличие в их составе минорных компонентов (галактозы, ксилозы, уроновых кислот, в некоторых случаях прочно связанного пептидного фрагмента) еще более усложняет структурный анализ водорослевых фукоиданов. В отличие от них несколько полисахаридов, выделенных из иглокожих, как оказалось, обладают линейной структурой с повторяющимися тетрасахаридны-ми звеньями, строение которых удалось установить [5 -8J.
Водоросли рода Laminaria, добываемые в крупных масштабах, могут наряду с фукусовыми служить доступным источником фукоиданов [15-18]. В частности, большой интерес представляет с этой точки зрения L. saccharina, которая уже в течение длительного времени используется для промышленного получения альгиновой кислоты и маннита [19], но фукондан при этом является отходом производства; его химическое строение, насколько нам известно, ранее не исследовалось. В данной работе проведена оценка этой водоросли как возможного сырья для выделения сул ьфатир о ванных полисахаридов и получены предварительные сведения о химическом строении содержащегося в ней фукоидана.
Результаты и обсуждение
Исходным материалом для извлечения полисахаридов послужили два образца L. saccharina (I и II), один из которых был собран в Белом, а другой - в Баренцевом море. Для характеристики их углеводного состава была использована методика определения маннита, описанная нами ранее [20], с последующим гидролизом биомассы и количественным определением образующихся нейтральных моносахаридов в виде ацетатов пол иолов методом гжх [21]. Найденные величины для глюкозы и фу козы дают представление о содержании в биомассе ламинарана и фукоидана соответственно (табл. I). Из данных таблицы можно заключить, что различие в географическом положении сказывается в первую очередь на накоплении резервных углеводов - маннита и ламинарана, но в гораздо меньшей степени влияет на содержание структурных полисахаридов.
Для препаративного выделения полисахаридов использовали методику экстракции, подробно описанную в одной из наших предыдущих работ [15]; однако из этой методики с целью ее упрощения была исключена стадия предварительной обработки сырья, предназначенная для удаления низкомолекулярных веществ, и применен несколько отличный температурный режим (см. "Экснер. часть"). В результате экстракции из каждого образца водоросли были получены препараты ламинарана, альгината и три фракции фукоидана, выходы и состав которых приведены в табл.2.
В соответствии с результатами предварительной оценки (табл. 1) более высокий выход ламинарана был получен из образца I. Выделенный полисахарид обладал характерной для линейных (1 —*- 3)-[3-глюканов ограниченной растворимостью в холодной воде и был очищен с помощью нескольких "перекристаллизаций" из воды [22].
20
Очищенный полисахарид имел [а],, -[3.0° (с 1.1; вода). В его составе кроме глюкозы был найден маннит (соотношение глюкоза - маннит 35 : 1); после восстановления ламинарана боргидридом натрия и гидролиза наряду с глюкозой обнаруживались сорбит и маннит в соотношении, близком к 1 : 1. Таким образом, подобно многим другим ламинаранам бурых водорослей полисахарид содержал М- и О-цепи примерно в равных количествах и имел среднюю степень полимеризации 18. Его спектр (" Я М Р (рис.1) соответствовал линейной молекуле из (1 —3)-связанных остатков (}-£>-глюкопиранозы [23]. Аналогичный препарат из образца II бъгл получен с гораздо меньшим выходом, содержал значительное количество примесей и подробнее не исследовался.
Препараты альгината натрия были выделены из обоих образцов водоросли с близкими выходами и, судя по величинам удельного вращения
([а]'о -104.5° и - 105.0° (с 0.3: вода) соо тветственно) и спектрам ПС-ЯМР (рис. 2), имели строение, типичное для этого класса полисахаридов [24, 25]. Однако происхождение водоросли существенно влияло на мономерный состав полученных альги-натов: соотношение О-м а нну р оно в ой и ¿--гулу реповой кислот (М/С), рассчитанное из спектров
НОН2С
C-l
..-О
Oil
С-5
С-6
С-3
С-2
С-4
105
100
95
90
85
80
75
70
65
60 м.д.
Рис. 1. Спектр С-ЯМ Р ламинарана из образца I водоросли L. saccharina.
13С-ЯМР, в Иа-альгинате I составило 2.20, а в Иа-альгинате II - 1,66.
Методика фракционной экстракции водоросли позволила получить три фракции фукоиданов, извлекаемых соответственно разбавленным водным раствором хлорида кальция, разбавленной соляной кислотой и 3% водным карбонатом натрия. В составе этих препаратов кроме фукозы и сульфата обнаруживались небольшие количества других нейтральных моносахаридов (галактозы, ксилозы, глюкозы) и уроновых кислот. Наибольший выход, наибольшее содержание фукозы и сульфата и наименьшее - уроновых кислот соответствовали фракции фукоидана 1 для обоих образцов водоросли. При исследовании биологических свойств было показано, что для этой же фракции наблюдается и наиболее высокая анти-коагулянтная активность [26]. Поэтому для препаративного получения фукоидана в количестве, необходимом для структурных исследований, была использована упрощенная методика, приводящая к высокосульфатированной фракции фукоидана без выделения прочих полисахаридов.
В качестве исходного материала был выбран образец II, содержащий меньше сопутствующих водорастворимых полисахаридов, В этом препаративном опыте был получен фукоидан Б в виде Са-соли с общим выходом 5.16% от сухой биомассы. Для его очистки и одновременного перевода в №-соль была проведена щелочная обработка по известной методике [27], которая не привела к потере сульфата и лишь способствовала удалению небольшого количества неидентифициро-ванных примесей. Модифицированный щелочью препарат (фукоидан БМ) был получен с выходом 90% от фукоидана Р (состав обоих препаратов
приведен в табл. 2). Мольное отношение фукозы и сульфата в них составило около 10:7. ¿-Конфигурация фукозы была по
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.