Таблица 1. Выходы и состав полисахаридных фракций, полученных при ионообменной хроматографии суммарного полисахаридного препарата F
Фракция Выход, % от F Нейтральные моносахариды, % Сульфат (SO3Na), % Ацетат (CH3CO), % Уроновые кислоты, %
Fuc Xyl Gal Man Glc
F1 38.5 34.5 5.6 5.4 1.0 - 12.7 1.8 11.8
F2 42.9 44.1 2.2 5.8 - - 22.9 4.0 5.9
F3 5.2 22.2 3.7 5.9 3.4 5.9 17.5 н.о. 3.2
молекулах. Эта программа включает выделение фукоиданов из многих видов бурых водорослей, их структурный анализ и биологические испытания, а также синтез различных сульфатирован-ных олигосахаридов, потенциальных фрагментов фукоиданов, для использования в качестве модельных соединений при химическом и биологическом исследовании природных полисахаридов. В частности, подробное изучение спектров ЯМР синтетических олигосахаридов [11-13] оказало большую помощь при расшифровке сложных спектров ЯМР природных фукоиданов. Нами было охарактеризовано строение полисахаридов, выделенных из Laminaria saccharina [14], Chorda filum [15] и трех представителей рода Fucus [1, 5, 16]. Данная работа посвящена структурному анализу фукоидана, выделенного из тихоокеанской бурой водоросли Analipus japonicus. Эта водоросль широко распространена в Японском море и относится к семейству Scytosiphonaceae, представители которого довольно слабо изучены с химической точки зрения. О полисахаридном составе A. japonicus в литературе имеются лишь самые предварительные сведения [17].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исходным материалом для выделения фукоидана послужил образец водоросли A. japonicus, собранный в Японском море. Водорастворимые по-
лисахариды экстрагировали из обезжиренной биомассы водоросли водным раствором СаС12 при нагревании, кислые полисахариды осаждали из экстракта прибавлением бромида гексадецилтри-метиламмония и затем переводили в водорастворимые натриевые соли. Выделенный таким образом суммарный препарат фукоидана (состав см. в "Эксперимент. части") далее очищали и фракционировали с помощью анионообменной хроматографии. Этим способом были получены три по-лисахаридные фракции, выходы и состав которых приведены в табл. 1. Для структурного анализа была выбрана фракция Б2, содержащая Х-фукозу, сульфат и ацетат в мольном соотношении 1.00 : 0.66 : 0.32, а также в небольших количествах галактозу, ксилозу и уроновые кислоты.
В ИК-спектре фукоидана Б2 наблюдались интенсивная полоса поглощения при 1260 см-1 (сульфатные группы), а также широкая несимметричная полоса поглощения с максимумом при 848 см-1, форма которой свидетельствовала о наличии в полисахариде как аксиальных, так и экваториальных сульфатных групп. Это означало, что сульфатные группы могут занимать любые положения в остатках фукозы. Спектры ЯМР (1Н и 13С) полисахарида, подобно аналогичным спектрам других водорослевых фукоиданов, были сложными и не интерпретировались полностью. Сигналы в аномерной (94-105 м.д.) и высокопольной (1618 м.д.) областях углеродного спектра (рис. 1) бы-
Fucp-C6
CH3CO
180 м. д. 100 90 80 70 60 50 40
Рис. 1. Спектр 13С-ЯМР нативного фукоидана F2. БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 33 № 1 2007
30 20 м. д.
Таблица 2. Состав (мол. %) нативного фукоидана (Б2) и его химически модифицированных препаратов: дезаце-тилированного (deAc), десульфатированного (deS) и десульфатированного и дезацетилированного (deSdeAc) фу-коиданов
Образец Рие Ху1 Gal SOзNa СН3СО Уроновые кислоты
Р2 45 3 4 30 13 5
deAc 54 5 5 30 - 6
deS 57 5 7 - 22 9
deSdeAc 68 9 11 - - 12
ли типичны для а-фукопиранозидов. Довольно интенсивные сигналы в районе 21-22 м.д. и при 175 м.д. подтверждали присутствие в фукоидане Б2 значительного количества ацетильных групп.
Для дальнейшего структурного анализа фукоидана Б2 потребовались упрощающие полисахарид химические модификации. Методом сольво-литического десульфатирования (нагреванием пиридиниевой соли полисахарида в диметилсуль-фоксиде с метанолом, ср. [5, 14-16]) с выходом 57.3% был получен десульфатированный полимер В результате сольволиза из полисахарида были удалены все сульфатные группы, в то время как содержание ацетильных групп практически не изменилось. При щелочной обработке фукоидана Б2 с выходом 61.0% был получен дез-ацетилированный полисахарид ^еАс). Аналогичная обработка десульфатированного фукоидана привела к получению полисахарида, полностью лишенного неуглеводных заместителей, десульфатированного и дезацетилированного фукоидана (deSdeAc), с выходом 75.9%. Состав модифицированных препаратов в сравнении с составом нативного фукоидана Б2 приведен в табл. 2.
Положение межмономерных связей в фукоидане устанавливали методом метилирования. Обработке метилиодидом и гидроксидом натрия подвергали десульфатированный препарат (deS) в условиях, обеспечивающих отщепление содержащихся в нем ацетильных групп и исчерпывающее метилирование гидроксилов. В продуктах гидролиза метилированного препарата в качестве главных компонентов были найдены 2,4-ди-О-метилфукоза, 2,3,4-три-О-метилфукоза и 2-0-метилфукоза, соотношение между которыми приведено в табл. 3. На схеме 1 изображен один
из возможных способов интерпретации этих данных в предположении, что полисахарид имеет в основе молекулы цепь из (1 —► 3)-связанных остатков фукопиранозы с единичными ответвлениями в виде остатков фукопиранозы, присоединенных главным образом по положениям 4, реже по положениям 2 основной цепи, причем на каждые 10 остатков фукозы в линейной цепи приходится примерно три разветвления по положению 4 и одно разветвление по положению 2.
Для подтверждения предложенной структуры было использовано расщепление препарата deSdeAc по Смиту. Полисахарид окисляли перио-датом натрия, окисленный полимер восстанавливали боргидридом натрия и подвергали мягкому кислотному гидролизу, в процессе которого главная часть расщепленного по Смиту вещества выпадала в осадок. Этот препарат был получен с выходом 26.5%. Минорная фракция расщепленного по Смиту полисахарида, сохранившая растворимость в воде, была выделена после отделения низкомолекулярных фрагментов с выходом 13.2%. Эта фракция характеризовалась пониженным содержанием сахаров и далее не исследовалась.
Метилирование вещества Sm-I показало, что его молекулы представляют собой практически линейные цепи, построенные из (1 —► 3)-связан-ных остатков фукопиранозы (табл. 3). Таким строением, очевидно, объясняется нерастворимость вещества в воде, что свойственно и ряду других полисахаридов с жесткой конформацией линейных молекул, таких, как целлюлоза, (1 —»- 3)-а-глюканы, (1 —»- 3)-а- и (1 —*- 4)-в-маннаны и др. [18]. Образование линейных молекул в результате расщепления deSdeAc по Смиту под-
■3)Рие(1 —3)Рие(1 —- 3)Рие(1—- 3)Рие(1 —- 3)Рие(1 —- 3)Рие(1 —» 3)Рие(1 — 3)Рие(1 —- 3)Рие(1 —» 3)Рие(1 -2 4 4 4
Рие Рие Рие Рие
Схема 1.
тверждает справедливость предположения о том, что в исходном полисахариде имеется главная цепь из (1-3)-связанных остатков фукопиранозы, а ответвления представлены преимущественно единичными остатками фукозы. В то же время следует отметить, что результаты метилирования 8ш-1 указывают на сравнительно небольшую молекулярную массу этого полимера (степень полимеризации около 20 моносахаридных остатков) и возможное наличие в его молекулах некоторого количества точек ветвления (табл. 3). Уменьшение молекулярной массы в результате расщепления по Смиту может происходить, если в главной цепи исходного полисахарида (ёе8ёеАс), наряду со связями 1 —► 3, присутствует несколько связей 1 —► 2 или 1 —► 4. Разветвленность 8ш-1 свидетельствует, что боковые ответвления в ёе8ёеАс могут изредка представлять собой не моносаха-ридные остатки, а более протяженные цепи.
Анализ продуктов метилирования нативного фукоидана (Б2) позволил обнаружить в полисахариде небольшое число концевых ^восстанавливающих остатков фукофуранозы (эта структурная особенность отмечалась ранее и для других фукоиданов [16, 19]), а также локализовать в нем сульфатные группы. Как видно из табл. 3, в продуктах гидролиза метилированного Б2 были найдены 2,4-ди-О-метилфукоза, незамещенная фу-коза, а также 3-О-метил- и 4-О-метилфукоза. Это означает, что в главной цепи имеются несульфа-тированные остатки фукозы, в то время как большинство сульфатных групп находится при С2 в 3,4-дигликозилированных остатках фукопиранозы или в положениях 2 концевых остатков
Таблица 3. Данные метилирования нативного фукоидана ^2), десульфатированного фукоидана (¿еБ) и фракции Бт-1 расщепленного по Смиту фукоидана ¿еБёеАс (мол. % частично метилированных и ацетили-рованных производных фуцита)
Положения О-метиль-ных групп Полисахаридный препарат
F2 deS Sm-I
2,3,5 (Fuc/) 3 - -
2,3,4 (Fuc^) 6 27 7
2,3 3 3 -
2,4 35 38 91
2 6 21 1
3 + 4 20 6 1
Fuc-ol 27 5 -
фукозы, которые одновременно сульфатированы по положениям 4 или 3. Часть сульфатных групп может быть также локализована в положениях 4 2,3-дигликозилированных остатков фукопиранозы. Ниже на схеме 2 изображен один из возможных вариантов размещения сульфатных групп (S), учитывающий эти данные метилирования.
Результаты химического исследования нативного фукоидана F2 и продуктов его модификации были дополнены данными спектроскопии ЯМР. Анализ спектров COSY, TOCSY и HSQC десульфатированного и дезацетилированного образца (deSdeAc) показал наличие в нем остатков а-фу-
- 3)Fuc(1 — 3)Fuc4S(1 3)Fuc(1 — 3)Fuc2S(1 — 3)Fuc(1 — 3)Fuc2S(1 3)Fuc(1 — 3)Fuc2S(1 3)Fuc(1 — 3)Fuc(1 -
2 4 4 4
t t t t
Fuc Fuc2,4S Fuc2,3S Fuc2,4S
Схема 2.
105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 м. д.
Рис. 2. Спектр 13С-ЯМР десульфатированного и дезацетилированного фукоидана ёе8ёеАе. Наиболее интенсивные сигналы принадлежат углеродным атомам (1 —► 3)-связанных остатков а-Х-фукопиранозы (отнесение см. в табл. 4, остатки А).
Таблица 4. Химические сдвиги сигналов (5, м.д.) в спектрах ХН- и 13С-ЯМР образца deSdeAc, зарегистрированных в D2O при 303 К
д
а-Ь^иср
I
А Б А 2
—-3)-а-Ь-Риср-(1—3)-а-L-Fucp-(1—»- ...—► 3)-a-L-Fucp-(1—»- 3)-a-L-Fucp-(1—»
4
Г
a-L-Fucp В
Остаток L-фукозы Протоны Атомы углерода
H1 H2 H3 H4 H5 H6 C1 C2 C3 C4 C5 C6
А —>-3)F
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.