m
Б И OOP ГА НИ ЧЕС КАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 7, с. 528 - 534
УДК 577:113.5
ПОЛНО РАЗМЕРНАЯ ДНК-КОПИЯ ГЕНОМА ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА. I. АНАЛИЗ 5'- И 3-КОНЦЕВЫХ НЕКОДИРУЮЩИХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОМА © 1995 г. Е. Ю. Добрикова, А. Г. Плетнев
Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Лаврентьева, 8 Поступила в редакцию 10.05.94 г.
С помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции получены фрагменты кДНК декодирующих участков генома вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Эти фрагменты клонированы в составе вектора рОЕМЗ, определена их нуклеотидная последовательность и показана гетерогенность З'-концевой нетранслируемой области РНК ВКЭ. С целью создания стабильной полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ в векторе на основе рВК322 клонированы 4 варианта кДПК вирусной РНК, различающиеся длиной и структурой З'-концевой последовательности.
Ключевые слова: И1ал>тгк1ае, полноразмерная ДНК-копия, некодирующая область генома, молекулярное клонирование, секвенирование.
Вирус клещевого энцефалита, представитель семейства Р1аутпс1ае [1 ], вызывает тяжелую ней-роинфекцию с поражением центральной нервной системы и высоким (до 30%) уровнем смертности [2]. Вирус распространен в Сибири и на Дальнем Востоке России, а также в ряде стран Восточной и Западной Европы (Польша, Венгрия, Чехия, Словакия, Австрия). Природные штаммы ВКЭ, различающиеся по серологическим характеристикам и клиническим проявлениям, делятся на два подтипа: европейский и дальневосточный [3].
Геном ВКЭ состоит из одноцепочечной "плюс"-РНК длиной около ¡1000 и.о., которая содержит короткие нетранслируемые 5'- и З'-области и единственную протяженную открытую рамку считывания и кодирует три структурных (С, М, Е) и семь неструктурных (N81, N823, Ш2Ь, N83, ^4а, И84Ь, N85) белков. Модекулярно-биологическое изучение флавивирусов сопряжено с рядом трудностей, которые обусловлены, с одной стороны, их пато-генностью для человека, а с другой - низким уровнем продукции вирусных белков и нестабильностью геномной РНК.
В последние годы для некоторых флавивирусов были сконструированы полноразмерные ДНК-копии [4-6], что значительно облегчило их изучение.
Принятые сокращения: ВКЭ - вирус клещевого энцефалита, ОТ-обратная транскрипция, ПЦР-полимеразная неп-ная реакция, и.о. - нуклеотидный остаток.
В настоящей работе мы сообщаем о конструировании и клонировании полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ в векторе на основе pBR322.
Ранее в нашей лаборатории была определена полная нуклеотидная последовательность РНК дальневосточного подтипа ВКЭ (штамм Софьин) и получена библиотека кДНК, содержащая всю кодирующую область вирусного генома [7J.
Фрагменты кДНК, соответствующие З'-концевой последовательности генома, получали, используя вирусную РНК, выделенную из зараженных ВКЭ клеток почки эмбриона свиньи. В качестве праймеров применяли 5'-32Р-меченые дезоксирибоолигонуклеотиды Р1 или Р10, комплементарные участкам вирусной РНК в положениях 768 - 788 и 73 - 92 соответственно (таблица). Прямое секвенирование продуктов ОТ выявило последовательность (5')AGAUUUUCUUGC, идентичную первым 12 н.о. РНК штаммов Нург и Neu-doeríl [8 - 10J. Сравнение нуклеотидных последовательностей РНК трех упомянутых штаммов ВКЭ показало, что их 5'-нетранслируемые и кодирующие области близки по структуре, которая согласуется с общими представлениями о строении РНК флавивирусов [11, 12J.
В то же время структуры 3'-нетранслируемой области различаются у разных штаммов ВКЭ. Так, З'-нетранслируемая область генома ВКЭ штамма Софьин (115 н.о.) [7] короче, чем у штамма Нург (461 н.о.), и в отличие от штамма Neudoejfl 110] не имеет ро1у(А)-тракта. Указанные различия в структуре и длине З'-некодирующих областей у
ПОЛНОРАЗМЕРНАЯ ДНК-КОПИЯ
529
Дезоксирибоолигонуклеотидные праймеры, использованные в обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции
Структура (5' —3')
Соответствие области генома (штамм Софьин)
CCCCTTCCTGTGAGATCTCCC Bglll
GGCGGGTCGGTACC AGCGGGTGTTTTTCCG AG Kpnl
AGATTTTCTTGCACGTGC
GGCGGGTCGGTACC(T)30 Kpnl
GGATCCGGTACCTTCCCGGCCATCCCC Kpnl
CCTTTCAAAAGCTTATGGGCAC HindlU
GGCGGGTCGGTACCGTTTAAAGTGCTCTTCAG Kpnl
GGCGGGTCGGTACC(T)30GTTTAAAGTGCTCTTCAG Kpnl
CGTTCACGACTGATCAAGCG
Комплементарен участку 768 - 788 Комплементарен 10741 - 10758 Гомологичен 1 - 18
Комплементарен З'-концу штамма Ыеис1огЯ
Комплементарен 123 - 139 Гомологичен 9915 - 9936 Комплементарен 10460- 10477
Р7 + о^о(Т)-тракт Комплементарен 73 - 92
разных штаммов ВКЭ обусловили необходимость более подробного изучения 3'-концевой последовательности генома дальневосточного подтипа ВКЭ.
Для изучения структуры З'-концевой области геномной РНК ВКЭ кДНК получали, используя вирусную РНК, выделенную из мозга зараженных мышей, по методу, предложенному С. Mandl [10]. 5'- и З'-Концы вирусной РНК лигировали с помощью Т4-РНК-лигазы, после чего получали кДНК концевых участков генома методами ОТ и ПЦР (рис. 1), применяя олигонуклеотидные праймеры. выбранные на основании нуклеотидной последовательности штамма Софьин (таблица). В качестве праймера для синтеза первой цепи кДНК использовали олигонуклеотид Р5, содержащий сайт рестрикции Kpnl и последовательность, комплементарную 5'-концевому участку вирусной РНК в положениях 123 - 139. Двухцепочечные фрагменты кДНК получали с помощью ПЦР и пары праймеров - Р5 и Р6. Праймер Р6 гомологичен последовательности вирусной РНК в положениях 9915 - 9936 и содержит сайт для эндонуклеа-зы рестрикции Hindin (таблица).
Продукты ПЦР представляли собой гетерогенный набор фрагментов кДНК длиной 700 - 900 н.о. Амплифицированные фрагменты кДНК клонировали в векторе pGEM3 по сайтам рестрикции
Крп\ и НтдШ. Рекомбинантные плазмиды отбирали методом молекулярной гибридизации с 32Р-меченым ДНК-фрагментом клона р9 [7]. Была определена первичная структура ДНК 36 ре-комбинантных клонов, 11 из которых (3, 5-7, 10, 13 - 17, 34) содержали последовательность 8* (рис. 2), 5 (5, 27, 29, 32, 35) имели точечные нукле-отидные замены, а остальные (1, 2, 8, 9, 11, 20, 25, 31, 33, 36) несли разные делеции по сравнению с 8*. Ни один из проанализированных клонов не содержал протяженного ро1у(А)-тракта, его максимальная длина составляла 9 н.о. в положениях 10421 - 10430, причем он содержал остаток цити-дина в положении 10426.
ДНК-клоны, содержащие индивидуальные З'-концевые последовательности, были получены из очищенной через бляшки вирусной РНК. Для получения двухцепочечных фрагментов кДНК использовали пару праймеров - Р6 и Р2. В этом случае только 2 из 16 исследованных клонов содержали делеции: один в положениях 10388 - 10434, другой в положениях 10427 - 10572. Последовательность ДНК в остальных клонах была идентична 8* или содержала точечные замены.
Чтобы проверить, имеется ли на З'-конце вирусного генома штамма Софьин ро1у(А)-тракт, наличие которого показано для штамма Иеис1оегП [8],
530
ДОБРИКОВА, ПЛЕТНЕВ
РНК вкэ
5'|-1 3'
5' I
РНК-лигаза фага Т4
3' 5'
(2)
праймер Р5 ОТ 3' 5'
4 3'
(3)
5' t-
Р6/Р5 — Р5
ПЦР 3' 5'
3'
-1 3'
(4)
Гидролиз HindUl-Kpnl
Р6
//mdlll
(5)
Нind 111
KPnl Hindlll Kpnl
ДНК-лигаза
фага Т4
Kpnl
pGEM3
pGEM3(5'-3')
Рис. I. Схема получения рекомбинантных плазмид, содержащих нетранслируемые области генома ВКЭ: (/) - лигирование 5'- и З'-концов вирусной РНК; (2) -синтез кДНК; (3) - накопление двухцепочечного фрагмента кДНК; (4)- подготовка фра! мента кДНК к клонированию; (5) - клонирование фрагмента кДНК в векторе рСЕМЗ.
РНК из очищенных вирионов или мозга зараженных мышей подвергали ОТ с помощью праймера Р4. Последующая ПЦР с парой праймеров Р6/Р4 не приводила к накоплению ДНК, что служит дополнительным доказательством отсутствия протяженного ро1у(А)-тракта на З'-конце вирусной РНК штамма Софьин.
Ни один из клонов, полученных на основе как очищенной вирионной РНК, так и РНК, выделенной из мозговой суспензии, не содержал последовательности, соответствующей последним 43 н.о. (положения 10435 - 10477, см. рис. 2), которая была определена ранее для штаммов Софьин и ЫеиЛоегП [7, 8]. Эта последовательность представляет собой прямой несовершенный повтор и предшествует ро!у(А)-тракту в геноме ИеЫоегЛ или завершает геном штамма Софьин, являясь частью короткой (115 н.о.) З'-концевой области. Этот повтор отсутствует также и в последовательности штамма Нург. Чтобы проверить, имеется ли эта последовательность в популяции вирусной РНК, синтез кДНК проводили с использованием праймера Р7, комплементарного З'-концевой последовательности короткого варианта вирусного
генома, а амплификацию фрагментов - с помощью праймеров Р6/Р7. Секвенирование полученных клонов подтвердило наличие З'-укоро-ченного варианта геномной РНК.
Таким образом, результаты описанных выше экспериментов показывают, что популяция РНК ВКЭ содержит по крайней мере два пула молекул: с короткой (115 н.о.) и длинной (около 440 н.о.) З'-нетранслируемой областью, причем пул с длинным З'-концом состоит из гетерогенного набора молекул, содержащих различные делеции и точечные нуклеотидные замены. З'-Концевая последовательность РНК штамма Нург и длинный 3'-конец (S*) штамма Софьин различаются на делецию в 65 и.о., соответствующую остаткам 10445 - 10511 в структуре штамма Нург, вставку остатка аденина между 10440-м и 10441-м остатками и делецию 10639-го остатка аденина в структуре РНК Нург. Остальная часть З'-нетранслируемой области двух штаммов имеет гомологию 91.9%, причем последние 97 н.о. полностью идентичны для обоих штаммов.
Согласно общим представлениям об организации генома флавивирусов [12], размер З'-концевой некодирующей области вирусной РНК варьирует от 400 до 600 н.о. и не имеет ро1у(А)-тракта. Структура длинного З'-конца РНК ВКЭ соответствует этим представлениям. Как известно, З'-кон-цевая нетранслируемая область флавивирусных РНК содержит сигнальные последовательности для РНК-зависимых РНК полимераз [12]. Но при сравнении первичной структуры З'-концевых областей некоторых флавивирусов (вируса Западного Нила, энцефалита Сент-Луис, японского энцефалита и вируса желтой лихорадки) заметной гомологии ну
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.