МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 3, с. 461-471
= МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА
УДК 577.21.06
ПОЛНЫЙ МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ ГЕНОМ ПАВЛИНЬЕГО МОРСКОГО ЯЗЫКА Pardachirus pavoninus (Pleuronectiformes: Soleidae) И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КОНТРОЛЬНОЙ ОБЛАСТИ У 13 ВИДОВ МОРСКИХ ЯЗЫКОВ#
© 2015 г. L. Gong12, W. Shi1, L.-Z. Si12, Z.-M. Wang3, X.-Y. Kong1*
1Key Laboratory of Tropical Marine Bioresources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, 510000 China 2University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100000 China 3Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, Zhoushan, 316021 China Поступила в редакцию 21.08.2014 г.
Принята к печати 30.09.2014 г.
Определена полная нуклеотидная последовательность митогенома павлиньего морского языка Pardachirus pavoninus (Lacepede, 1802). Митогеном длиной 16536 п.н. содержит 13 белоккодирующих генов, 22 гена тРНК и два гена рРНК, а также одну контрольную область (CR). Участок начала репликации L-цепи (OL), обычно локализованный в кластере wancy, у P. pavoninus утрачен, а гены располагаются так же, как в мтДНК других рыб. Сравнение нуклеотидных последовательностей CR у 13 видов морских языков показало, что в митогеноме P. pavoninus утрачен фрагмент 5'-концевой части CR ра-взмером 211 п.н., поэтому она укорочена до 872 п.н. Идентифицированы типичные консервативные блоки (TAS, CSB-F, E, D, C, B, A, CSB-1,2,3). У семи из 13 видов морских языков в CR есть тандемные повторы. Обсуждаются возможные механизмы образования тандемных повторов. Получены консен-сусные последовательности консервативных единиц в CR морских языков, а также данные для проведения молекулярно-филогенетических исследований Soleidae и Pleuronectiformes.
Ключевые слова: камбалообразные, гетероплазмия, тандемные повторы, последовательность, ассоциированная с терминацией.
THE COMPLETE MITOCHONDRIAL GENOME OF PEACOCK SOLE Pardachirus pavoninus (Pleuronectiformes: Soleidae) AND COMPARATIVE ANALYSIS OF THE CONTROL REGION AMONG 13 SOLES, by L. Gong1,2, W. Shi1, L.-Z. Si1,2, Z.-M. Wang3, X.-Y. Kong1* (1Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, 510000, Guangzhou, China; 2University of Chinese Academy of Sciences, 100000, Beijing, China; 3Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, 316021, Zhoushan, China; *e-mail: xykong@scsio.ac.cn). The complete mitogenome of the peacock sole Pardachirus pavoninus (Lacepnde, 1802) was determined. The total length is 16.536 bp, containing 13 protein-coding genes, 22 tRNA genes and two rRNA genes, as well as one control region (CR). The L-strand replication origin (Ol), which is typically located in the WANCY cluster, is lost in P. pavoninus. The gene arrangement is identical to those in typical fishes. Comparison of CR sequences among 13 soles revealed that a 211-bp fragment at the 5'-end of the CR was lost in the P. pavoninus mitogenome, contributing to its short sequence with a length of 872 bp. The typical conservative blocks (TAS, CSB-F, E, D, C, B, A, CSB-1, 2, 3) were identified. Seven out of 13 soles existed tandem repeats in the CR and the possible mechanisms of the formation were explored. These results would provide the consensus sequences of conserved units in the sole CR as well as molecular data for phylogenetic studies on Soleidae and Pleuronectiformes.
Keywords: flatfish, OL, heteroplasmy, tandem repeat, termination associated sequence. DOI: 10.7868/S0026898415030064
Морские языки — бентосные плоские рыбы, у которых оба глаза находятся на правой стороне головы [1]. Из-за большого фенотипического
#Статья представлена авторами на английском языке.
* Эл. почта: xykong@sesio.ac.cn
сходства разных видов 8о1е1ёае их систематика, основанная на традиционных методах, существенно различается числом и номенклатурой
таксонов [1—4]. Этим вызвана потребность в молекулярных маркерах, необходимых для уточнения спорных вопросов систематики 8оЫёае и камбалообразных.
Митохондриальная ДНК (мтДНК) активно используется в филогенетическом анализе благодаря малому размеру, высокому содержанию в клетке и высокой скорости эволюции [5—11]. Главная некодирующая область, так называемая контрольная область (СЯ), или смещаемая петля ^-петля), содержит главные регуляторные элементы репликации и экспрессии митогенома, такие как сайты инициации репликации Н-цепи и транскрипции Н- и Ь-цепей. Из-за высокой скорости эволюции и функциональной значимости СЯ считается одной из наиболее интересных частей митогенома позвоночных [12—14]. Опубликованы результаты детального сравнения СЯ в мтДНК рыб [15—19]. Несмотря на это, у видов 8о1е1ёае она до сих пор относительно мало изучена.
Павлиний морской язык РагёасЫгыз рауоптт (Ьаеереёе, 1802) принадлежит к семейству 8о1е1ёае отряда Р1еигопееШогте8, обитающего в прибрежных водах Индийского и Тихого океана [20]. Наиболее значительным отличием этого вида является темный ободок на теле и несколько темных пятен в центре [21]. Подкожные экстракты морского языка токсичны, а слизь обладает, по-видимому, способностью отпугивать акул [22].
В представленной работе определена полная нуклеотидная последовательность митогенома Р. рауоптт. Описаны главные параметры мито-генома и структура генов. Проведено сравнение нуклеотидной последовательности СЯ Р. рауот-пш и 12 других видов морских языков. Поанали-зированы особенности организации повторов и механизмы их образования. Мы надеемся, что полученные консенсусные последовательности консервативных единиц СЯ морского языка, а также данные молекулярного анализа будут по-
лезны для филогенетических исследований Soleidae и Pleuronectiformes.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Сбор образцов, амплификация и секвенирова-ние. Особи P. pavoninus были отловлены в Guangdong (КНР). Части эпаксиальных мышц вырезали и выделяли суммарную геномную ДНК, используя наборы SQ DNA Kit ("OMEGA", КНР), следуя протоколу производителя. Праймеры, использованные для амплификации мтДНК P. pavoninus, приведены в табл. 1. Фрагменты, полученные при ПЦР-амплификации, секвенировали путем "праймерной прогулки" или, если необходимо, очищенные продукты ПЦР встраивали в вектор pMD19-T ("TaKaRa"), затем трансформировали компетентные клетки Escherichia coli и клонированные продукты секвенировали, используя ABI 3730 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems"). Полную нуклеотидную последовательность мтДНК депонировали в GenBank под номером KJ433565.
Биоинформатика. Секвенированные фрагменты были собраны в полную последовательность митогенома с использованием программ CodonCode Aligner v3 ("CodonCode Corp.", США) и BioEdit v7 [23]. Аннотацию и определение границ белоккоди-рующих генов и генов рРНК проводили с помощью NCBI-BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Гены тРНК и потенциальные структуры клеверного листа идентифицировали с помощью программы tRNAscan-SE 1.21 [24], задавая при необходимости пороговое значение, равное 1. Карту генов митогенома P. pavoninus создали, используя CGView [25]. Для сравнения последовательностей CR морских языков (табл. 2) проводили множественное выравнивание CR 13 видов, используя Clustal X 2.0 [30].
Таблица 1. Праймеры, использованные в работе
Прямой праймер Нуклеотидная последовательность (5'—3') Обратный праймер Нуклеотидная последовательность (5'—3')
Z15 ATTAAAGCATAACHCTGAAGATGTTAAGAT F2671 AGATAGAAACTGACCTGGAT
Z2625 GTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACAT F6746 GCGGTGGATTGTAGACCCATARACAGAGGT
YL-6746R ACTAACCTCCTCATAAACC YL-COIF CGCCGATTATTAGAGGAA
R6754 CTAAGCCATCCTACCTGTG F11089 TTTAACCAAGACCRGGTGATTGGAAGTC
YL-COIIR GAACGACCCTCATCTCAC YL-13347F CTACTGGGGTGAAGATAA
Z10818 TTYGAAGCAGCCGCMTGATACTGACAYTT F13413 TAGCTGCTACTCGGATTTGCACCAAGAGT
Z13347 AAGGATAACAGCTCATCCGTTGGTCTTAGG H15149 AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA
YL-13413R GTTCACATTACCCGAGAC F17147 TAGTTTARTGCGAGAATCCTAGCTTTGGG
Z17054 GYCGGTGGTTARAATCCTCCCTACTGCT YL-17114F TCTTGGCGGGATGTTGAT
L17114 RCGCCCAAAGCTAGDATTC F49 GGCCCATCTTAACATCTTC
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Организация генома
Полный митогеном P. pavoninus состоит из 16536 п.н., что укладывается в диапазон размеров секвенированных к настоящему времени митоге-номов других видов Pleuronectiformes (от 16417 п.н. у Cynoglossus abbreviatus и C. lineolatus до 18139 п.н. у Reinhardtius hippoglossoides). Геном содержит 13 бе-локкодирующих генов, два гена рРНК, 22 гена тРНК и одну CR. Организация генов в нем такая же, как у других рыб, и большинство генов находится в тяжелой цепи (H-цепь) за исключением ND6 и восьми генов тРНК (рис. 1).
Суммарный нуклеотидный состав L-цепи равен (%): 29.1 (А), 29.5 (С), 16.4 (G) и 25.0 (T) соответственно, содержание A + T = 54.0%. Двенадцать межгенных спейсеров, варьирующих по длине от 1 до 13 п.н., содержат в общей сложности 43 п.н. Перекрывающиеся участки (общей длиной 26 п.н.) выявлены между белоккодирующими генами ATP8 и ATP6, ATP6 и COIII, ND4L и ND4, ND5 и ND6; это четыре наиболее значительных
перекрывания между белоккодирующими генами, известные у других видов позвоночных, или между генами тРНК (tRNA-Ile и tRNA-Gln, tRNA-Gln и tRNA-Met, tRNA-Thrи tRNA-Pro) (табл. 3).
Белоккодирующие гены, гены рРНК и тРНК
Общий размер 13 белоккодирующих генов составил 11426 п.н. Из них 12 начинаются с ATG-кодона за исключением гена COI, у которого стартовый кодон GTG, как у большинства рыб [17, 31, 32]. В большинстве генов в качестве стоп-кодона используются TAA, TA или T, тогда как ген ND6 заканчивается на AGG, который обычно не служит стоп-кодоном в митогеномах других позвоночных.
Наиболее часто используется лейцин (17.03%), наиболее редко — цистеин (0.79%). Полный анализ использования кодонов в 13 белоккодирую-щих генах выявил заметную тенденцию против использования G (10.3%) в третьем положении кодона, которое свободно от давления отбора
Таблица 2. Характеристики контрольной области 13 видов морских языков
Сокращенное название Номер в GenBank Длина, п.н. Тандемный повтор
Вид общая без TR* положение aÄ число копий размер мин. энергия* Ссылка
Aesopia cor
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.