Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 4, с. 443-450
УДК 577.112.083.3
ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ, СПОСОБНЫХ РАСПОЗНАВАТЬ АМИНОКИСЛОТНУЮ ЗАМЕНУ Glu/Lys В ПОЛОЖЕНИИ 129 СУРВИВИНА
© 2014 г. Т. Д. Волкова*, #, Е. В. Аскарова*, **, Д. О. Короев*, А. В. Камынина*, М. П. Филатова*, И. Ю. Якупов*, **, О. М. Вольпина*
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
**Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова, Москва
Поступила в редакцию 27.11.2013 г. Принята к печати 26.12.2013 г.
Сурвивин — это онкофетальный белок, являющийся ингибитором апоптоза и принимающий участие в регуляции клеточного деления. Функции сурвивина зависят от его мономер-димерного состояния. Вследствие природного полиморфизма, в положении 129 аминокислотной последовательности сурвивина может находиться остаток Glu либо Lys. Последний способен к ацетилированию, и только белок, содержащий ацетилированный остаток Lys129, склонен к образованию димера. Таким образом, антитела, распознающие аминокислотную замену Glu129Lys, могут служить инструментом в структурно-функциональных исследованих сурвивина. Для получения целевых антител были синтезированы фрагменты сурвивина, включающие остаток 129, проведена иммунизация кроликов синтетическими пептидами и аффинная очистка полученных антител на сефарозе, конъюги-рованной с соответствующими пептидами. С помощью иммуноферментного анализа и иммуноблота было показано, что полученные аффинно-очищенные антитела способны распознавать аминокислотную замену Glu129Lys в последовательности рекомбинантного и эндогенного сурвивина.
Ключевые слова: сурвивин, полиморфизм E129K, синтетические пептиды, антитела.
DOI: 10.7868/S0132342314040149
ВВЕДЕНИЕ
Сурвивин — это один из представителей семейства белков-ингибиторов апоптоза [1]. Он вступает в сложные взаимодействия с многочисленными белками-партнерами [2—7] и благодаря этому участвует в регуляции таких важных процессов в жизни клетки, как деление и ингибиро-вание апоптоза [8—10]. Предполагают, что сурвивин может присутствовать в клетке в виде мономера и димера [11] и что выполняемые белком функции зависят от его структурного состояния. Было показано, что мономер сурвивина регулирует клеточное деление, встраиваясь в ходе митоза в комплекс "хромосомных пассажиров" [12]. С
Сокращения: АТ — антитела; НАФ — неполный адъювант Фрейнда; ПАФ — полный адъювант Фрейнда; Fmoc — 9-флуоренилметоксикарбонил; PBS — фосфатносолевой буфер, содержащий 2.7 мМ KCl, 140 мМ NaCl, 8.1 мМ Na2HPO4, 1.5 мМ KH2PO4, pH 7.4; RecSurv - рекомби-нантный сурвивин; TBS-T — буфер, содержащий 20 мМ Tris-HCl, 137 мМ NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.6.
# Автор для связи (тел.: +7(495) 336-57-77; эл. почта: tdvol@mx.ibch.ru).
помощью мутантной формы сурвивина, не способной к димеризации, было установлено, что мономер сурвивина принимает участие также в ингибировании апоптоза [13]. В то же время функции димера сурвивина остаются малоизученными. Появились данные о том, что взаимодействие димера сурвивина с транскрипционным фактором 8ТЛТ3 приводит к снижению экспрессии белков БСЬХЬ и МСЫ и, возможно, стимулирует апоптоз в опухолевых клетках [11].
Считают, что мономерная и димерная формы сурвивина в клетке находятся в состоянии динамического равновесия [11, 14]. Один из предполагаемых механизмов регуляции баланса мономер-димер сурвивина заключается в дезацетилирова-нии/ацетилировании остатка лизина в положении 129 аминокислотной последовательности белка. Вследствие природного полиморфизма в данном положении может находиться либо остаток лизина (К129), либо остаток глутаминовой кислоты (Е129). Сурвивин, содержащий Е129 либо дезацетилированный К129, находится преимущественно в форме мономера. Белок, содержащий
Таблица 1. Синтетические фрагменты сурвивина чело-
№ Пептид Аминокислотная последовательность
(I) 122-(E129)-134 KEFEETAEKVRRA-G
(II) 122-(K129)-134 KEFEETAÄKVRRA-G
(III) 126-E129-132 ETAEKVR-G
(IV) 126-(K129)-132 ETAÄKVR-G
(V) 126-(acK129)-132 ETAacKKVR-G
* Нумерация аминокислот дана по последовательности сур-вивина-а человека (Swiss Prot ID O15392). Жирным курсивом выделена аминокислотная замена E129K.
остаток ацетилированного лизина-129 (acK129) склонен к образованию димера [11]. В настоящее время активно ведутся исследования функций ацетилированной формы сурвивина и ее прогностического значения при лечении онкозаболеваний. Есть данные о том, что сурвивин, ацетилиро-ванный по остатку Lys-129, накапливается в ядре, где взаимодействует с фактором STAT3, ингибируя его транскрипционную активность [11]. Было показано, что высокий уровень ацетилированной формы сурвивина связан с благоприятным прогнозом лечения и менее агрессивными типами рака молочной железы [15]. В то же время исследования функций и прогностического значения сурвивина, содержащего в положении 129 остаток Glu, не проводятся, что, по-видимому, связано с отсутствием антител, специфических к данной форме белка.
Таким образом, антитела, способные распознавать замену остатка Glu на остаток Lys (E129K) в сурвивине, являются необходимым инструментом не только для его структурно-функциональных исследований, но и для прогноза эффективности лечения онкологических заболеваний. Мы полагаем, что подобные исследования необходимы, так как среди различных этнических групп от 4 до 42% представителей являются гетерозиготными по E129K, а от 2 до 17% представителей —
гомозиготными по E129E [11]. Цель настоящей работы заключалась в получении специфических антител, способных селективно выявлять сурви-вин, содержащий в положении 129 остаток Glu или Lys.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для получения антител, способных различать аминокислотную замену E129K в последовательности сурвивина, были выбраны и синтезированы фрагменты белка, включающие аминокислотный остаток 129 (табл. 1).
Были синтезированы два тринадцатичленных пептида (I) и (II) с остатком Glu либо Lys в положении 129 и два их укороченных аналога (III) и (IV). Укороченные фрагменты запланированы для уточнения специфичности антител и для получения антител более узкой направленности. Кроме того, был синтезирован пептид (V), содержащий ацетилированный остаток Lys(Ac)-129, для получения антител, селективно связывающихся с аце-тилированной формой сурвивина.
Пептиды были синтезированы твердофазным методом по Fmoc-схеме. Для оптимизации схемы синтеза в качестве С-концевой аминокислоты всех пептидов использовали остаток глицина. Степень чистоты синтетических пептидов была подтверждена данными аминокислотного анализа, масс-спектрометрии, ВЭЖХ и составляла более 95%.
Все синтезированные пептиды имели корректный аминокислотный состав и молекулярные массы m/z для [M + H]+ (табл. 2).
Для получения антител были использованы тринадцатичленные пептиды (I) и (II) с остатком Glu либо Lys в положении 129, а также укороченные фрагменты: (III) с остатком Glu-129 и (V) — с остатком Lys(Ac) 129. Этими четырьмя пептидами иммунизировали животных, исследовали специфичность связывания сывороток крови животных, затем отбирали наиболее активные сыворотки для выделения из них антител, способных распознавать аминокислотную замену E129K в
Таблица 2. Характеристики синтетических пептидов
Обозначение Аминокислотная последовательность [m + H] + М теор. Время удерживания*, мин
122-(E129)-134 (I) KEFEETAEKVRRA 1593 1592 9.19
122-(K129)-134 (II) KEFEETAKKVRRA 1592 1591 11.18
126-(E129)-132 (III) 126etaekvr132g 889 888 5.03
126-(K129)-132 (IV) 126etakkvr132g 888 887 4.34
126-(acK129)-132 (V) 126ETAacKKVR132G 930 929 5.87
* Колонка Jupiter 5ц C18 300A 250 х 4.6 мм, градиент концентрации ацетонитрила в 0.1% TFA от 10 до 70% за 1 ч при расходе элюента 1 мл/мин.
Таблица 3. Связывание кроличьих сывороток с пептидами и рекомбинантным сурвивином в условиях ИФА
Иммуноген Титр связывания с пептидом, —lg разведения Титр связывания с рекомбинантным сурвивином, —lg разведения
(I) 122-(E129)-134 5.7 3.8
(II) 122-(K129)-134 5.4 3.1
(III) 126-(E129)-132 4.2 <1.3
(V) 126-(acK129)-132 2.8 <1.3
Таблица 4. Перекрестное связывание противопептидных сывороток
Иммуноген Антиген*
122-E129-134 (I) 122-K129-134 (II) 126-E129-132 (III) 126-K129-132 (IV) 126-K129(Ac)-132 (V)
122-E129-134 (I) 5.7 5.4 5.0 <1.3 <1.3
122-K129-134 (II) 5.4 5.4 <1.3 3.7 3.7
126-E129-132 (III) 4.0 <1.3 4.2 <1.3 <1.3
126-acK129-132 (V) <1.3 2.5 <1.3 2.8 2.8
* Приведен титр антител, —lg разведения.
последовательности рекомбинантного и эндогенного сурвивина.
Иммунизацию проводили конъюгатами пептидов с гемоцианином улитки (KLH) в качестве высокомолекулярного белкового носителя. Способность полученных сывороток связывать пептиды и рекомбинантный сурвивин исследовали с помощью ИФА (табл. 3).
Проведенное исследование показало, что иммунизация пептидами (I) и (II) приводила к образованию антител, имеющих высокие противо-пептидные титры и эффективно связывающихся с рекомбинантным сурвивином. Укороченные фрагменты (III) и (V) стимулировали образование антител с гораздо более низкими титрами. Антитела к ним, содержащиеся в сыворотках, были не способны связываться с рекомбинантным белком.
На следующем этапе исследований была определена способность полученных сывороток распознавать замену E129K в синтетических пептидах. Для этого было изучено перекрестное связывание сывороток с пептидами (I)—(V) (табл. 4).
Проведенное исследование показало, что сыворотка к пептиду (I), содержащему остаток Glu в положении 129, связывалась не только с исходным пептидом (I), но и с пептидом (II), содержащим остаток Lys-129. Такое же отсутствие специфичности проявила и сыворотка к пептиду (II). Эта сыворотка реагировала и с пептидом (II) и с пептидом (I).
Связывание этих же сывороток с укороченными аналогами (III)—(V) происходило избирательно. Сыворотка к пептиду (I) реагировала только с аналогом (III), содержащим остаток Glu в поло-
жении 129, и не реагировала с пептидами (IV) и (V), содержащими в данном положении остаток Lys и Lys(Ac), соответственно. И наобор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.