ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 448, № 3, с. 355-357
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.113.6:578.833.2
ПОЛУЧЕНИЕ АПТАМЕРОВ К ФРАГМЕНТУ ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА Е ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
© 2013 г. И. Г. Кондратов, М. А. Хаснатинов, У. В. Потапова, В. В. Потапов, С. А. Левицкий, Г. Н. Леонова, Е. В. Павленко, И. С. Соловаров, Н. Н. Деникина, Н. В. Кулакова, С. И. Беликов
Представлено академиком М.А. Грачевым 06.04.2012 г. Поступило 16.04.2012 г.
БО1: 10.7868/80869565213030262
Клещевой энцефалит (КЭ) — одна из самых распространенных и опасных природно-очаговых вирусных инфекций лесной зоны Евразии [1, 2]. Проблема ранней терапии КЭ не решена. Применяемый в практике специфический иммуноглобулин имеет ряд недостатков [3]: производство иммуноглобулина человека ограничено колич-ством доступных доноров, что приводит к дороговизне и регулярному дефициту этого препарата; велик риск побочных реакций (анафилактический шок) и заражения другими социально значимыми вирусами (прежде всего вирусом гепатита С и ВИЧ).
Современным трендом в терапии вирусных заболеваний является замещение специфических антител ДНК-лигандами — аптамерами [4—6]. Разрабатываются аптамерные противовирусные препараты для гепатита С [7, 8], ВИЧ-1 [9, 10] и других вирусов [11, 12]. Основной проблемой ап-тамерной терапии вирусных заболеваний является доставка аптамеров в клетку для возможности контакта с белками-мишенями [13]. Целью работы стало получение аптамеров к фрагменту поверхностного белка Е вируса клещевого энцефалита, так как он доступен для воздействия апта-меров вне клетки-хозяина.
Лимнологический институт
Сибирского отделения Российской Академии наук,
Иркутск
Научный центр проблем семьи и репродукции человека Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Иркутск Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения
Российской академии медицинских наук, Владивосток
Целевой домен белка Е определяли методом молекулярного моделирования пространственных структур. В банке данных пространственных структур белков с помощью веб-сервиса www.bri-shur.com выбрали структуру белка Е вируса КЭ 1URZ и методом моделирования по гомологии построили трехмерную структуру исследуемого белка. Валидность полученной модели проверили в эксперименте молекулярной динамики продолжительностью 6 нс. Физико-химические параметры выбрали с учетом физиологических условий размножения ВКЭ: pH крови 7.4, содержание ионов Na и K 0.15M. Полученную модель визуализировали в программе USCF Chimera версии 1.5.2.
Выбранный фрагмент гена белка Е клонировали в вектор pET-22b(+) ("Novagen", Германия) по сайтам NdeI и XhoI. Рамку считывания уточняли прямым секвенированием плазмид. Отвечающие требованиям конструкты субклонировали в экс-прессионный штамм B834(DE3)pLysS и индуцировали IPTG (0.1 мМ). Рекомбинантный фрагмент белка Е очищали на колонке Ni-NTA Resin ("Invitrogen", США). Масс-спектрометрический анализ полученного белка проводили на приборах UltraFlex и MaXis (MALDI, Esi-Q-TOF соответственно, "Bruker Daltonics", США). Очищенный рекомбинантный белок иммобилизовали на планшетах Nunk Immuno™ LockWell™ Module/Strip Plates и проводили SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential еnrichment) аптамеров. Исходный пул ДНК-олигонуклеотидов имел состав: 5'-/FAM/-ctcctctgactgtaaccacg-(N)40-gcataggtagtc-cagaagcc. После 15 циклов селекции пул аптамеров клонировали в вектор pGEM-T Easy ("Prome-ga", США) и секвенировали.
Для оценки противовирусной активности пула аптамеров использовали изолят 92М сибирского субтипа ВКЭ с титром в культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) 4.2 • 108 БОЕ/мл.
356
КОНДРАТОВ и др.
Рис. 1. Пространственная структура тримерной формы поверхностного белка Е вируса клещевого энцефалита в двух проекциях. Субъединицы белка Е в тримерной конформации обозначены оттенками серого цвета. Черным выделена область одной субъединицы, отобранная для селекции аптамеров.
(бляшкообразующих единиц в миллилитре). Каликвотам суспензии ВКЭ добавляли равные объемы культуральной среды: чистой (контроль) и с пулом аптамеров после 15-го раунда селекции в концентрации 150 пмоль/мл (эксперимент). После инкубации 15 мин при 23°С определяли концентрацию инфекционного вируса (БОЕ/мл) с помощью титрования бляшкообразующих единиц в культуре клеток СПЭВ. Индекс нейтрализации рассчитывали как отношение титра контрольной суспензии вируса к титру суспензии вируса после обработки пулом аптамеров.
На рис. 1 показаны функциональные домены, экспонированные на поверхности вириона (единственные таргетные участки вирусного белка Е). Таким образом, согласно расчетам, целевым доменом для воздействия на вирусный белок Е является выбранная для селекции аптамеров петля, соответствующая аминокислотным остаткам с 50 по 250.
При обработке библиотекой аптамеров в концентрации 150 пмоль/мл в течение 15 мин индекс I нейтрализации ВКЭ составил в среднем 1§I = = 1.16 ± 0.05, т.е. количество инфекционного вируса в суспензии уменьшилось приблизительно в 17.5 раза. Такой показатель сравним с результатами реакции нейтрализации коммерческого иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита (производитель НПО "Микроген", Россия) в разведении 1 : 80 (1&! от 1.2 до 1.88). Поскольку высока вероятность присутствия в проанализированной библиотеке групп аптамеров с разной ин-
гибирующей активностью, можно рассчитывать на повышение этого показателя при проведении дополнительных раундов селекции.
Применение аптамеров, специфичных к поверхностному белку вируса клещевого энцефалита, на наш взгляд, не ограничивается только терапевтическим использованием. Возможно создание на основе аптамеров диагностических платформ, отличающихся не только высокой специфичностью, но и скоростью анализа. Помимо этого полученные аптамеры могут быть использованы для выделения живых вирусных частиц из природных и клинических образцов (клещи, сыворотки крови человека). Так как в настоящее время наибольшее распространение для диагностики вируса КЭ получили системы ИФА, основанные на иммобилизации вирусных частиц на антителах, после получения положительного результата выделение вируса для дальнейших исследований в физиологических условиях невозможно. В случае проведения иммобилизации на аптамерах комплекс вирион-ап-тамер легко разрушается дезоксирибонуклеазой и вероятность получения интактных вирусных частиц весьма высока.
Работа выполнена при поддержке ФЦП "Исследования и разработки..." ГК № 16.512.11.2258 в рамках интеграционного проекта СО РАН № 141 и совместного проекта НАН Беларуси и СО РАН № 22.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 448 № 3 2013
ПОЛУЧЕНИЕ АПТАМЕРОВ К ФРАГМЕНТУ ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА
357
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гниель Д. Клещевой энцефалит (К 65-летию открытия). Ситуация по клещевому энцефалиту в мире. Вирус — возбудитель — заболевание и профилактика. Владивосток, 2002. С. 180—186.
2. KaiserR. // Infect. Dis. Clin. 2008. V. 22. № 3. P. 561575.
3. Девятков М.Ю., Лебедева Т.М., Комков Б.Д. и др. К вопросу профилактики клещевого энцефалита. http://www.rusmedserv.com/epidinf/ke_st.htm
4. Klussmann S. The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications. Weinheim: Wiley - VCH, 2006. 518 p.
5. Wu Cuichen, Hu Jia, Zou Yuan, et al. // Progress Chem. 2010. V. 22. № 8. P. 1518-1530.
6. Арчаков А.И., Бодоев Н.В., Радько С.П. и др. // Био-мед. химия. 2007. Т. 53. № 1. С. 5-24.
7. Hwang B, Cho J.S, Yeo H.J., et al. // RNA. 2004. № 10. P. 1277-1290.
8. Kikuchi K, Umehara T, Fukuda K., et al. // NAR. 2005. № 33. P. 683-692.
9. Held D.M., Kissel J.D., Patterson J.T., et al. // Front. Biosci. 2006. № 11. P. 89-112.
10. Michalowski D. Pat. 20090305281. US. 2009.
11. Zong-Qiang Cui, Qian Ren, Hong-Ping Wei, et al. // Nanoscale. 2011. № 3. P. 2454-2457.
12. Wang J., Jiang H, Liu F. // RNA. 2000. № 6. P. 571583.
13. James W. // J. Gen. Virol. 2007. V 88. P. 351-364.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 448 № 3 2013
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.