УДК 577.3
ПОЛУЧЕНИЕ, БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СТРУКТУРА РЕКОМБИНАНТНОЙ ЭНДО-1,4^-КСИЛАНАЗЫ XylE
© 2012 г. Т.В. Федорова1, А.М. Чулкин1, Е.А. Вавилова1,
И.Г. Майсурадзе1, А.А. Трофимов1,2, И.Н. Зоров1, В.П. Хотченков1, К.М. Поляков1,2, С.В. Беневоленский1, О.В. Королева1*, В.С. Ламзин3
1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Ленинский просп., 33, 119071 Москва; факс: +7(495)954-2732, электронная почта: koroleva@inbi.ras.ru
2 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, ул. Вавилова, 32, 119991 Москва; факс: +7(499)135-1405,
электронная почта: isinfo@eimb.ru 3 European Molecular Biology Laboratory (EMBL), c/o DESY, Building 25A, Notkestraße 85, 22603 Hamburg, Germany; fax: +49(0)4089-902149; E-mail: info@embl-hamburg.de
Поступила в редакцию 20.06.12 После доработки 02.07.12
Ген xylE эндо-1,4-Р-ксиланазы десятого семейства гликозил-гидролаз мицелиального гриба Penicillium canescens экспрессирован под контролем сильного промотора гена bgaS, кодирующего ß-галактозидазу P. canescens и получен штамм — продуцент эндоксиланазы XylE. Фермент выделен в гомогенном состоянии (специфическая активность 50 ед/мг) и исследованы его физико-химические и биохимические свойства. Максимальная ферментативная активность наблюдалась при рН 6,0 и 70°. Эндоксиланаза XylE является высокостабильным ферментом, период полуинактивации фермента т1/2 при 60° равен 7 ч. Кинетические параметры, определенные по березовому ксилану, равнялись 0,52 мг/мл (Km и 75 мкМоль/минумг (Vmax). Получены кристаллы эндоксиланазы XylE и решена трехмерная структура с разрешением 1,47 А. Впервые определена кристаллическая структура эндо-1,4-Р-ксиланазы 10 семейства, содержащая углеводы и уникальную циклическую структуру на С-конце.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Penicillium canescens, ксиланаза, гомологичная экспрессия, XylE, 3D структура, биохимические и физико-химические свойства, субстратная специфичность.
Р-1,4-ксилан является основным полисахаридом клеточной стенки растений и вторым после целлюлозы по распространенности углеводом в растительных организмах. С точки зрения химического строения ксилан — гетеропо-лимер, состоящий из линейной цепочки р-(1,4)-Б-ксилоз, частично ацетилированных и имеющих разную степень замещения в боковых цепях Б-глюкоронозил- и а-Ь-арабинозил-единица-ми. Сложность структурной организации затрудняет деградацию данного гетерополимера. В природе этот процесс осуществляет широкий спектр гидролаз. Ключевыми ферментами в деградации ксилана являются эндо-р-(1,4)-ксила-назы (ЕС 3.2.1.8), расщепляющие внешние р-(1^4) связи в немодифицированных остатках с
* Адресат для корреспонденции.
образованием ксилоолигосахаридов различной длины [1].
Интерес к ксиланазам резко возрос в последние годы благодаря возможности их использования в биотехнологии. Использование ксила-наз включает целлюлозобумажную, пищевую, кормовую и текстильную промышленности [1, 2]. Также они применяются в производстве биотоплива [1, 2] и технологиях конверсии растительных остатков для получения моносахаридов [1, 2]. Именно поэтому в настоящее время у различных микроорганизмов, включая бактерии и грибы, активно проводится поиск ксиланаз, обладающих свойствами, необходимыми для их использования в промышленности. Грибы как источник ксиланаз представляют наибольший интерес для биотехнологии благодаря высокому уровню продукции внеклеточных ферментов
9
1433
[1]. Большинство эндоксиланаз мицелиальных грибов принадлежит к 10-му и 11-му семействам гликозил-гидролаз: ксиланазы с большой молекулярной массой (более 30 кДа) и низкой изоэлект-рической точкой — к 10-му семейству, а ферменты с низкой молекулярной массой (19—25 кДа) и высокой изоэлектрической точкой — к 11-му семейству [3]. Ксиланазы 10-го семейства глико-зил-гидролаз деполимеризуют более короткие незамещенные ксилопираназильные остатки по сравнению с ксиланазами 11-го семейства [4].
Для некоторых видов мицелиальных грибов обнаружены различные формы ксиланаз. Ферменты, продуцируемые одним организмом, могут принадлежать как 10-му семейству гликозил-гидролаз, так и 11-му. Гены xynB и xynC P. funicu-losum кодируют две ксиланазы 11-го семейства, ген xylD — ксиланазу 10-го семейства [5—7]. У Penicillium purpurogenum также известны две кси-ланазы, принадлежащие к разным семействам [8, 9]. При исследовании P. canescens — природного продуцента ксиланаз — установлено наличие семейства генов, кодирующих эндоксилана-зы [10, 11], причем эти эндоксиланазы имеют низкую степень гомологии и относятся к разным ветвям филогенетического дерева. Установленная закономерность наблюдается для эн-доксиланаз как 10-го, так и 11-го семейства. Полученные данные позволили высказать предположение о дивергенции генов этой группы на раннем этапе эволюции [11]. Как показали наши предварительные исследования, уровень продукции большинства эндоксиланаз P. canescens при культивировании на средах различного состава или крайне низкий, или вообще отсутствует. Таким образом, не представляется возможным охарактеризовать новые ферменты при использовании природного штамма P. canescens. Поэтому целью настоящей работы являлась гомологичная экспрессия одного из генов данного семейства — xylE — для получения рекомбинант-ного фермента и последующее исследование его свойств и определение 3D структуры.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и условия культивирования. В работе использовали штаммы P. canescens F178 (ВКПМ) и его мутант по гену нитратредуктазы (niaD-) и гену эндоксиланазы (xylA-) P. canescens PCE-7 [12]. Состав сред для культивирования, условия культивирования грибов соответствуют методикам, описанным в [13]. Методика протопластирования и котрансформации штамма РСЕ-7 описана в [12, 13]. Для плазмидной трансформации использовали штамм E. coli XL1-Blue («Stratagene», USA).
Методы работы с ДНК. Рестрикцию, лигиро-вание, дефосфорилирование, осаждение нуклеиновых кислот, электрофорез ДНК, плазмидую трансформацию E. coli и выделение плазмидной ДНК выполняли по методике, приведенной в [14]. Выделение грибной хромосомной ДНК проводили согласно [13]. Очистку ПЦР-фраг-ментов из агарозного геля проводили с использованием набора реактивов GFX PCR и Gel Band Purification Kit («GE Healthcare», США), согласно рекомендации производителя.
Определение нуклеотидных последовательностей. Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов ДНК определяли с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems в Центре коллективного пользования «Геном» ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН.
Анализ последовательностей. Последовательность сигнального пептида была предсказана с использованием программы SignalP (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Молекулярный вес зрелого пептида был предсказан с помощью программы Vector NTI 7.0. Поиск гомологий в GenBank проводили с помощью сервера BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Для множественных выравниваний аминокислотных последовательностей белков применяли программу ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalW).
Гомологичная экспрессия гена xylE в P. canescens. Конструирование плазмиды для экспрессии гена xylE. Для экспрессии клонированного нами ранее гена эндоксиланазы xylE P. canescens [11] использовали сильный промотор гена bgaS внеклеточной ß-галактозидазы P. canescens [15].
Фрагмент гена xylE длиной 1450 п.н. с введенным сайтом рестрикции BglII после терминатора транскрипции, содержащий полную кодирующую последовательность и терминатор-ную область, был амплифицирован с использованием PfuI полимеразы и пары праймеров XlBgD (5'-TTGCTCACCATGCGTCCATCCCTA-GTGATCG-3') и XlBglR (5-CCAGATCTATACC-CAGACCAAACGA-3').
Полученный фрагмент гена xylE был состыкован с 3'-концом промотора гена bgaS с помощью «вложенной» ПЦР. Для этого был амп-лифицирован ПЦР-фрагмент промотора гена bgaS с использованием праймеров CR1337D (5'-CGTACACCAAGGCTGGGGATGAGGAG -GACC-3') и BgXlR (5'-TGGACGCATGGTGAG-CAAAGTCGACGA-3') и ДНК плазмиды pPCG2.6 [16], несущей полный ген ß-галактозидазы bgaS в качестве матрицы. Смесь ДНК полученного фрагмента и ДНК ПЦР-фрагмента гена xylE бы-
ла амплифицирована с использованием прайме-ров CR1337D и XlBglR.
Полученный ПЦР-фрагмент, длиной ~2670 п.н., содержащий неполную последовательность промотора гена bgaS, кодирующую и терминатор-ную области гена xylE, обрабатывали ферментами рестрикции NcoI и BglII, после чего клонировали в плазмидный вектор pPCG2.6. Полученная конструкция была проверена секвенирова-нием на отсутствие мутаций.
Культивирование трансформированного штамма P. canescens PCE-7/pBGXylE — продуцента ксила-назы Е. Культивирование штамма P. canescens PCE-7/pBGXylE проводили в качалочных колбах в среде следующего состава (ферментационная среда, г/л): жом свекловичный — 30; пептон — 50; KH2PO4 — 25. Жидкую ферментационную среду засевали суспензией конидий (1 х 107 спор на 100 мл) и инкубировали на качалке при температуре 30°, 200 об/мин в течение 6 дней.
Выделение и очистка рекомбинантного фермента. Внеклеточные белки осаждали высаливанием сульфатом аммония (80% насыщения) и отделяли центрифугированием при 10 000 g в течение 20 мин при 4°. Осадок ресуспендировали в 30 мл 35 мМ Tris-HCl, pH 8,25 (буфер A). После повторного центрифугирования для удаления нерастворившейся фракции при 30 000 g в течение 20 мин при 4°, надосадочную жидкость обессоливали на колонке с Sephadex G-25M (2,6 х 40 см), уравновешенной буфером А.
Обессоленный раствор белка (50 мл) наносили на колонку с DEAE-Toyopearl 650M (2,6 х х 34 см, GE Healthcare), уравновешенную буфером А. Белки элюировали градиентом NaCl (0—0,2 M) в том же буфере со скоростью 7,5 мл/мин. Ксиланаза элюировалась одним пиком при 0,125 M NaCl. Фракции, проявлявшие ферментативную активность, собирали и осаждали сульфатом аммония (27% насыщения). Осадок белка отделяли центрифугированием при 30 000 g в течение 20 мин при 4°.
Дальнейшую очистку фермента проводили с помощью хроматографии на Phenyl-Sepharose FF HS (размер колонки — 1,6 х 36 см, «GE Healthc
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.