ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 6, с. 578-586
УДК 577.355:581.132
ПОЛУЧЕНИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТА C-41 Chlamydomonas reinhardtii - СУПЕРПРОДУЦЕНТА
Z-КАРОТИНА
© 2014 г. В. Г. Ладыгин
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: ladyginv@rambler.ru Поступила в редакцию 07.02.2014 г.
Изучен состав каротинов и ксантофиллов мутанта С-41 одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii Dang. — суперпродуцента Z-каротина. Установлено, что у мутанта С-41 нарушены светособирающие комплексы и комплекс реакционного центра ФС-II. При этом он сохранял достаточно высокую (до 46%) фотосинтетическую активность и способность накапливать хлорофил-лы и каротиноиды (до 50%). Изучение состава каротинов показало, что в отличие от клеток дикого типа К(+), накапливающих 95% ß-каротина и 5% а-каротина, в клетках мутанта С-41 содержалось 43% ß-каротина, 19% ß-зеакаротина и 38% Z-каротина. Высокий уровень накопления биомассы мутанта С-41 позволил рекомендовать его для использования в качестве суперпродуцента Z-каротина в фотобиотехнологии.
DOI: 10.7868/S0555109914050055
В настоящее время активно ведутся исследования роли каротиноидов в структурно-функциональной организации мембран хлоропластов, функционировании пигмент-белковых комплексов фотосистем I и II [1—4] и защитных реакций виолаксантинового и лютеин-эпоксидного циклов, а также антиоксидантных свойств каротиноидов, используемых в медицине и фармакологии [5—8]. Однако роль ^-каротина, а также а-каротина и производных от него ксантофиллов (т.е. а-ка-ротиноидов) в формировании и функционировании мембран хлоропластов до настоящего времени остается мало изученной [7—9]. Известно, что а-каротиноиды синтезируются только в хлоро-пластах зеленых водорослей и высших растений с оксигенным фотосинтезом и наличием двух фотосистем, состоящих из 4-х пигмент-белковых комплексов [5, 10, 11].
Мутант С-41 не содержит а-каротина и а-ксан-тофиллов: лютеина и лороксантина [12, 13], поэтому может служить моделью для изучения участия этих пигментов в формировании пигмент-белковых комплексов фотосистем I и II СЫатуйотопаз гвтНагШи. Показано, что у мутанта С-41 нарушен ген Сг(Ь-в, ответственный за биосинтез фермента ликопин-е-циклазы [3—6], что обусловливает высокое накопление ^-каротина [12, 13].
Поскольку мутация гена Сг(Ь-в не влияла на биосинтез и накопление предшественников Р-ка-ротина и цепь биосинтеза Р-ксантофиллов [13], мутант С-41 может найти широкое практическое применение в медицине и фармакологической
промышленности, в частности при создании про-тивоонкологических средств.
Показано, что у мутанта С-41 одновременно с ß-каротином (43%) накапливаются ß-зеакаротин (19%) и значительное количество Z-каротина (38%), который в норме у водорослей присутствует лишь в следовых количествах [13, 14]. Следовательно, мутант С-41 можно использовать как суперпродуцент Z-каротина [12, 13]. Штамм С-41 способен накапливать хлорофилл и каротиноиды до 60—70% от их содержания в клетках Ch. reinhardtii дикого типа К(+) [13, 14]. Этот штамм светоустойчив и жизнеспособен даже в фотоавтотрофных условиях роста. Скорость клеточных делений штамма С-41 в миксотрофных условиях роста сравнима с клетками дикого типа К(+), что позволило наращивать большое количество биомассы и использовать ее как для теоретических исследований, так и получения чистых каротиноидов [5, 15—18].
Цель работы — изучение физиологических характеристик и состава каротинов и ксантофиллов нового мутанта С-41 одноклеточной зеленой водоросли Ch. reinhardtii Dang.
МЕТОДИКА
В работе использовали штамм дикого типа К(+) и новый мутантный штамм С-41 одноклеточной зеленой водоросли Ch. reinhardtii Dang. Для выращивания использовали модифицированную минеральную среду [19] следующего состава (г/л): NH4Cl - 0.40; MgSO4 • 7H2O - 0.10;
СаС12 • 2Н20 - 0.05; К2НР04 - 0.72; КН2Р04 - 0.36; Ма3С6Н507 • 5.5Н20 - 0.50; СН3С00№ • 3Н20 -2.00; дрожжевой экстракт - 1.0; раствор микроэлементов - 1.0 мл/л. Водоросли СИ. гвткаМШ культивировали как в жидкой среде при 27-35°С, так и на агаризованной, содержащей 15-20 г/л агар-агара, при 23-25°С. Оптимальная освещенность жидких сред составляла 13-15 тыс. лк, ага-ризованных - 3-5 тыс. лк [19, 20].
Количество клеток водоросли СИ. гвткаМШ в суспензии подсчитывали в камере Горяева. Рассчитывали сухую биомассу 109 клеток.
Содержание хлорофиллов и каротиноидов в ацетоновых экстрактах водорослей определяли спектрофотометрически при 470, 645 и 663 нм на спектрофотометре "НкаеЫ-557" (Япония) [19, 21].
Состав каротиноидов анализировали методами бумажной и тонкослойной хроматографии [15-17]. Компоненты каротинов экстрагировали хлороформом, ксантофиллов - этанолом (96%). В экстрактах каротиноиды определяли спектрофото-метрически на спектрофотометрах "НИаеЫ-557" и "8Ытаё2и-ЦУ160" (Япония), используя спектры поглощения и их вторые и четвертые производные [11].
Метод выделения и солюбилизации хлорофилл-белковых комплексов мембран хлоропла-стов был модифицирован [22, 23]. Клетки суспензировали в 0.05 М трис-НС1-буфере, рН 7.5, содержащем 0.3 М сахарозы и 0.01 М М%С12, и разрушали ультразвуком на установке УЗДН-1 (Россия) при 4°С двукратной обработкой в течение 20 с при частоте 15 кГц и силе тока 0.2 А. Неразрушенные клетки осаждали центрифугированием при 3000 % 5 мин. Мембраны хлоропластов из надосадочной части отделяли центрифугированием при 20000 20 мин, промывали 2 мл 0.05 М трис-НС1-буфера, рН 7.8, содержащего 0.001 М ЭДТА, и определяли содержание хлорофилла. Затем осадок мембран обрабатывали 0.5%-ным раствором додецилсульфата натрия (ДДС-№) в весовом соотношении 10 : 1 (мг/мг хлорофилла). Раствор (0.05-0.1 мл), содержащий 0.5 мг хлорофилла в 1 мл, наносили на 8.2%-ный полиакрила-мидный гель (ПААГ). Электрофорез проводили в присутствии ДДС-Ма в течение 45-60 мин при 4°С (сила тока на дорожку составляла 4-8 мА) [22, 23].
Спектры поглощения хлорофилла (А) и их первые (А1 = ДА/ДХ) и вторые (А2 = Д2А/Д^2) производные целых клеток регистрировали в 0.1 см кювете на спектрофотометре НйаеЫ1-557 при температуре жидкого азота (-196°С). Средняя ошибка измерения не превышала ±0.5 нм [10, 11].
Спектры флуоресценции хлорофилла целых клеток и их вторые производные регистрировали при температуре жидкого азота (-196°С) с помо-
щью установки, описанной ранее [24, 25]. Флуоресценцию хлорофилла возбуждали синим светом при 435 или 480 нм. Оптическая ширина щелей возбуждающего и анализирующего монохроматоров была равна 3 нм, величина шага дифференцирования — 0.2 нм, поглощение образцов — 0.05—0.1 [25].
Фотохимическую активность реакционных центров ФС-I и ФС-II определяли как в суспензии клеток in vivo, так и в фрагментах хлоропластов, используя методы, описанные в работах [26, 27]. Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла ФС-II в суспензии клеток in vivo (AF) измеряли с помощью фосфороскопи-ческой установки, описанной ранее [26]. Этот прибор использовали для измерения индуцированных светом изменений поглощения при 700 нм в фрагментах хлоропластов, связанных с фотоокислением П700 — хлорофилла реакционного центра ФС-I. Регистрировали также реакции фотовосстановления 2,6-дихлорфенолиндо-фенола (ДХФИФ) реакционными центрами ФС-II и фотоокисления ДХФИФН2 реакционными центрами ФС-I [26—28].
Для электронно-микроскопических исследований структуры хлоропластов клетки фиксировали 1%-ным раствором OsO4 в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.4, в течение 1—1.5 ч при 0°C. Затем обезвоживали в серии растворов этанола (от 50 до 100%) и безводного ацетона и заливали в Эпон-812. После полимеризации получали срезы на микротоме "LKB" (Швеция), которые контрастировали ура-нилацетатом и цитратом свинца, и просматривали в микроскопе JEM-7A (Япония) [10, 29].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Получение мутанта С-41-суперпродуцента Z-ка-ротина. Для получения мутантного штамма С-41 клетки дикого типа 137С mt+, обозначенного как К(+), выращивали при освещенности 15 тыс. лк в течение 2 сут при 27°C в фотоавтотрофных условиях в сосудах, содержащих 250 мл минеральной среды. Для получения суспензии с высоким содержанием зооспор (до 95%), выросшую культуру инкубировали в темноте в течение 12 ч. Суспензию (5 мл) клеток (1 млн клеток/мл) облучали у-лучами Cs137 в дозе 200 Грей при мощности 5 Грей/мин [19, 30]. Облученные клетки высевали на чашки Петри с агаризованной ацетатной средой. Через 10—14 сут роста на свету (3 тыс. лк) при 25°C вырастали зеленые и светло-зеленые колонии клеток диаметром 3—5 мм. Мутантные колонии светло-зеленой окраски (С-мутанты) пересевали для получения необходимого количества биомассы и анализировали с помощью спек-трофотометрических и хроматографических методов [15, 16, 21]. На основании результатов анализа каротинов (рис. 1) был отобран мутант С-41,
ную часть составлял Z-каротин с максимумами поглощения при 409 и 434 нм (рис. 1в).
Методом тонкослойной хроматографии [18, 29] было установлено, что мутантный штамм накапливал до 35—40% Z-каротина от суммарного содержания каротинов, в то время как в клетках дикого типа этот пигмент не накапливался.
Морфологические и физиологические признаки.
Клетки Ch. reinhardtii имели овальную или шаровидную форму диаметром 7—15 мкм. При выращивании на свету на средах, содержащих 2% агар-агара, после 10—14 сут роста клетки дикого типа К(+) и мутанта С-41 образовывали колонии зеленого и светло-зеленого цвета диаметром 3—5 мм. В жидкой минеральной среде, содержащей 0.2% ацетата натрия, плотность суспензии клеток после 2—3 сут роста достигала 30—40 х 106 кл./мл. В среде без ацетата натрия мутант С-41 рос медленнее. Однако при добавлении 0.2% ацетата натрия скорость клеточного деления восстанавливалась, а скорость роста штамма С-41 была такая же, как и у клеток дикого типа К(+).
Состав каротиноидов. Анализ каротиноидов методом тонкослойной хроматографии показал, что накапливающий большое количество Ç-каротина клетки дикого типа К(+) Ch. reinhardtii накаплива-[12, 13, 29]. Анализ спектров поглощения ß-каро- ли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.