научная статья по теме ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ BODIPY-МЕЧЕННОГО ЗОНДА ДЛЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Химия

Текст научной статьи на тему «ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ BODIPY-МЕЧЕННОГО ЗОНДА ДЛЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 4, с. 505-508

= ПИСЬМО РЕДАКТОРУ

УДК 577.113.4

ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ BODIPY-МЕЧЕННОГО ЗОНДА ДЛЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

© 2015 г. Е. В. Ильницкая*, Ю. Н. Кононевич**, А. М. Музафаров**, ***, С. А. Ржевский****, И. А. Шадрин****, Е. В. Бабаев****, В. И. Мартынов*, А. А. Пахомов*, #

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 2Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 28 3Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН, 117393, Москва, ул. Профсоюзная, 70 4МГУ имени М.В. Ломоносова, Химический факультет, 119899, Москва, Воробьевы горы Поступила в редакцию 12.12.2014 г. Принята к печати 26.02.2015 г.

При помощи реакции азид-алкинового циклоприсоединения получен флуоресцентный зонд для количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени ^РСЯ) с зеленой флуоресцентной меткой 4,4-Дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза-8-индацен (тетраметил-ВОВ1РУ ТМВ). Проведено его сравнение с аналогичным зондом на основе флуоресцеина. Показано, что флуоресцентные зонды с ТМВ флуорофором также могут быть использованы в дРСЯ.

Ключевые слова: qPCR, флуоресцентные зонды, хромофор, BODIPY, клик, TaqMan.

DOI: 10.7868/S0132342315040065

ВВЕДЕНИЕ

Олигонуклеотидные зонды для количественной ПЦР (qPCR) на основе пары флуоресцентный краситель—тушитель типа TaqMan позволяют количественно определять с высокой чувствительностью и специфичностью целевой участок анализируемой ДНК [1]. Между тем выбор флуоресцентных меток для конкретного зонда обычно ограничен тем набором флуорофоров, которые есть в наличии у отдельного поставщика. В настоящей работе использована схема получения флуоресцентных зондов для qPCR, в которой к оли-гонуклеотиду с тушителем флуоресценции на одном конце и азидной группой на другом при помощи "клик"-реакции присоединяется алкин-содержаший флуорофор. При таком подходе выбор флуорофоров становится шире за счет набора алкин-производных красителей, которые есть на рынке, или которые могут быть синтезированы самостоятельно [2—4].

Сокращения: FAM — флуоресцеин; BODIPY — 4,4-Дифтор-4-бора-3а,4а-диаза-8-индацен; TMB — 1,3,5,7-тетраметил-BODIPY; TBTA — трис(^-бензилтриазолилметил)амин; FRET — ферстеровский резонансный перенос энергии; qPCR — количественная ПЦР; qRT-PCR — количественная ПЦР с обратной транскрипцией. # Автор для связи (тел.: +7(495) 336-51-11; факс: +7 (495) 336-61-66; эл. почта: alpah@mail.ru).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве флуоресцентной метки был выбран 4,4-Дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-ди-аза-8-индацен (тетраметил-ВОЭ1РУ, ТМВ), поскольку этот краситель обладает высоким коэффициентом экстинкции и квантовым выходом, что должно обеспечивать высокую чувствительность зонда. Однако, ТМВ обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами, что ограничивает его применение для мечения биологических объектов. В настоящей работе был получен ТМВ содержащий зонд типа ТадМап и оценена перспектива использования подобных зондов для дРСЯ. На первом этапе было получено карбоксильное производное ТМВ (рис. 1а, соединение (1)). Синтез осуществляли по методике, описанной ранее [5]. Для дальнейшего конъюгирования с азидопроизводным олигонуклеотида соединение (1) было этерифицировано пропаргиловым спиртом (рис. 1а, соединение (2)). При помощи "клик" реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения между азидом и алкином [6] флуоресцентный краситель был присоединен к олигонуклеотиду (рис. 1б), в результате чего был получен ТадМап олигонуклеотидный зонд с флуорофором на 5'-кон-це и тушителем флуоресценции на З'-конце. Как было отмечено выше, ТМВ является гидрофобным

N

А

Б Б

(1)

БСС N

сн^ Г в" / \ Б Б

(2)

(б)

^А/и ТМБ N3

+ V .....нити внф;

Си(11)-ТБТА

ТМБ Аскорбиновая кислота

* N11111 ......... Бнс[]

Рис. 1. Схема синтеза флуоресцентного БОБ1РУ-зон-да. а — получение алкинового производного ТМБ; б — "клик"-присоединение ТМБ к олигонуклеотиду.

соединением, что потенциально может влиять на результаты дРСЯ анализа, проводимого в водных растворах. Поэтому в качестве контроля также был получен зонд с часто используемым флуоресцеи-ном (БАМ) вместо ТМБ.

Для проверки полученных зондов был использован дЯТ-РСЯ анализ экспрессии гена Р-акти-на, выделенного из эпителиальной ткани воздухоносных путей крысы. Ген Р-актина обычно конститутивно экспрессируется и служит точкой отсчета для определения относительной экспрессии других генов [7]. В нашем случае было достаточно того, что ген гарантированно экспрессиру-ется в анализируемой ткани. Первую цепь ДНК получали путем обратной транскрипции суммарной РНК анализируемой ткани. Затем разведения полученной ДНК 1 : 10, 1 : 100 и 1 : 1000 использовали в качестве матрицы в дРСЯ экспериментах с использованием синтезированных ТМБ- или БАМ-содержащих зонодов. Как зонд, содержащий ТМБ, так и зонд с БАМ показали сходные результаты (рис. 2). Номер порогового цикла в обоих случаях изменялся от 20 до 27 для минимального и максимального разведений соответственно. Параметры уравнения полученных калибровочных графиков также оказались очень близкими.

Номер цикла = А + В х 1§(разведение).

и

я р

о %

о

Н

28 г

26

24 -

22

20 -

св Ч М

и

Я р

о %

о

28

26 -

24

22

20 -

2

^ (разведение) (б)

2

^ (разведение)

Рис. 2. дРСЯ калибровочные графики для БАМ-зонда (а) и БОБТРУ-зонда (б).

Коэффициенты А и В составили 31.3 ± 0.2 и —3.9 ± 0.1 для зонда с БАМ соответственно. Для зонда с ТМБ А = 30.5 ± 0.1, В = -3.53 ± 0.07.

Кроме того, мы провели дРСЯ с добавлением к реакционной смеси 5% DMSO для предотвращения возможной агрегации ТМБ в воде. Полученные калибровочные графики (данные не показаны) оказались близки таковым для образцов без DMSO. Вероятно, это объясняется солюбилизи-рующим эффектом сильнополярного олигонук-леотида, к которому присоединен флуорофор. Таким образом, гидрофобные свойства ТМБ не оказали значительного влияния на эффективность дРСЯ.

В заключение, в работе продемонстрировано, что при помощи "клик" реакции азид-алкиново-го циклоприсоединения можно получать зонды для дРСЯ типа ТадМап с нужным флуорофором. Нами был синтезирован алкинсодержащий ТМБ

1

3

1

3

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 41 № 4 2015

ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ BODIPY-МЕЧЕННОГО ЗОНДА

507

флуорофор, который затем был конъюгирован с азидсодержащим олигонуклеотидом. Результаты qPCR показали, что олигонуклеотидные зонды с TMB можно применять в qPCR наравне с гидрофильными флуоресцентными метками, такими как FAM.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пропаргиловый эфир 3-(4,4-Дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза^-индацен-8-ил)про-пионовой кислоты (2). К раствору 38 мг (0.12 ммоль) 3-(4,4-Дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза^-индацен-8-ил)пропионовой кислоты (1) в 20 мл сухого ацетонитрила в атмосфере аргона добавляли 30 мг (0.145 ммоль) DCC и 14 мкл (0.24 ммоль) пропаргилового спирта, смесь оставляли на ночь при перемешивании, затем отфильтровывали, растворитель упаривали на роторном испарителе, и полученное твердое вещество очищали методом препаративной хроматографии на силикагеле (элюент — толуол, Rf = 0.4). Выход: 25 мг (61%), крист. вещество темно-красного цвета, ESI-MS, m/z: 359.15 [M+H]+, 339.15 [M-F]+. 1Н-ЯМР (CDCl3): 2.44 (6H, c, CCH3), 2.49-2.51 (1H, т, J 2.35, CCH), 2.52 (6H, c, CCH3), 2.62-2.67 (2H, м, J1 8.8, J2 2.58, COCH2-CH2), 3.313.35 (2H, м, J1 8.8, J2 2.8, COCH2-CH2), 4.74 (2H, д, J 2.35, OCH2), 6.07 (2H, уш. с, ArH). 13C-ЯМР (CDCl3): 14.44, 16.36, 23.44, 35.09, 52.45, 75.19, 77.23, 122.01, 131.21, 140.38, 142.82, 154.8, 170.84.

Флуоресцентные зонды типа TaqMan получали путем конъюгации алкинзамещенного красителя (соединение (2) либо FAM-алкина ^-(проп-2-ин-1-ил)-5-карбоксамид-флуоресцеин, Lumi-probe, США)) с азидсодержащим олигонуклеотидом (Syntol, Россия) с применением катализатора Cu(I)-TBTA (Lumiprobe, США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Очистку зондов осуществляли при помощи ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой С4 (Phenomenex), уравновешенной 100 мМ ацетата аммония в градиенте ацетонитрила (с 8 до 60% ацетонгитрила за 40 мин), скорость потока 0.7 мл/мин. Детекцию меченных олигонуклеотидов вели одновременно по двум длинам волн при 260 и 495 нм. Время выхода флуоресцентных зондов с красителями FAM и TMB составило 29 и 34 мин (38 и 44% ацетонит-рила) соответственно.

Суммарную РНК для qRT-PCR выделяли из замороженных, измельченных в жидком азоте образцов эпителиальной ткани воздухоносных путей крысы. Выделенную с помощью набора RNeasy Mini kit (Qiagen, США) стабильную фракцию суммарной РНК обрабатывали ДНК-азой RQ1 Rnase-Free Dnase (Promega, США). Качество полученной

РНК оценивали по результатам электрофореза в агарозном геле. Чистоту препарата РНК определяли спектрофотометрическим анализом. Для синтеза первой цепи кДНК брали 1 мкг суммарной РНК и использовали набор МШТ-ишуегза1 (Евроген, Россия) в соответствии с протоколом фирмы-производителя.

Анализ экспрессии гена Ь-АС крысы ^М_031144.3, GenBank) проводили методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (дРСЯ) с использованием набора реактивов с Тад ДНК-полимеразой (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя. Использовались следующие паймеры: грА^Рог: 5'-AGCCATGTACGTAGCCATCCA-3'; грА^Я^: 5'-TCTCCGGAGTCCATCACAATG-3'. Для специфической детекции продуктов амплификации были применены ТадМап-зонды с последовательностью 5'-(F)TGTCCCTGTATGCCTCTGGTCG-TACCAC(BHQ1)-3', где Р - флуорофор FAM либо ТМВ, BHQ1 — тушитель флуоресценции. Для получения достоверных результатов каждую qPCR проводили в трех повторах и с использованием отрицательного контроля на приборе АНК-32 (ДНК-Технология, Россия), температурный режим: 1 цикл: 95°С — 300 с, 50 циклов: 62°С — 50 с, 95°С — 15 с.

БЛАГОДАРНОСТИ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-1301478).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ryazantsev D.Y., Tsybulsky D.A., Prokhorenko I.A.,

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком