БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 6, с. 479 - 480
ПИСЬМА РЕДАКТОРУ
УДК 547.96.02
ПОЛУЧЕНИЕ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НОВЫХ КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ КОМПЛЕКСОВ ЛЕКТИНА ГОРОХА С Я-ГЛЮКОПИРАНОЗОЙ И /)-МАННОПИРАНОЗОЙ
© 1995 г. И. Ю. Михайлова, И. Н. Цыганник*, Ю. Д. Фонарев, Ю. В. Куликов, В. 3. Плетнев
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и 10.А. Овчинникова РАН, 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
Поступило в редакцию 12.01.95 г. Ключевые слова: лектин гороха, кристаллический комплекс; рентгеноструктурный анализ.
Пектины - углеводсвязывающие белки неиммунной природы, агглютинирующие клетки и/или преципитирующие глюкоконъюгаты. Связывание углеводов лектинами происходит специфично и обратимо, без нарушения ковалентной структуры. Эти белки широко распространены в живой природе, но их функциональная роль остается пока малоизученной. Наиболее хорошо исследованы лектины семян овощных растений - гороха, чечевицы, конских бобов (фавин), канавалии мечевидной (конканавалин А), семян Lathyrus ochrus (LoL-изолектины). У лектинов этой группы выявлена тесная гомология по первичной и пространственной структурам (см. [1, 2] и цитируемые там работы). Очень интересным представляется выяснение природы тонких различий в углеводной специфичности лектинов [3 - 5J. Эффективность такого рода исследований существенно повышается при наличии детальной информации о трехмерной структуре комплексов лектинов с угле-зодами.
Объект настоящего исследования - лектин гороха (Pisum sativum) - принадлежит к группе ман-нозо- и глюкозоспецифичных Са2+, Мп2+-содер-жащих лектинов (димер с молекулярной массой около 52 кДа). Структура одного из таких комплексов, полученного вымачиванием кристаллов свободного лектина гороха в растворе иодпроиз-водного глюкозы - бензил-2-ацетамидо-2,3-Диде-зо кси - 3 - я од - a-D - г л ю копира н оз ид а - установлена нами рентгеновскими методами с разрешением 1.8 A [6J. При этом молекула углевода была обнаружена только в одном из двух связывающих цен-
* Автор для переписки.
тров димера белка с относительно низким коэффициентом заполнения [7]. Кроме того, замена в использованном производном глюкозы кислорода на иод в положении 3 не могла не привести к искажению структуры стабилизирующих водородных связей.
Для получения более точного представления о стереохимической организации активного центра нами была разработана методика приготовления качественных кристаллических комплексов лектина гороха с природными углеводами. Для выделения и очистки белка была использована незначительно модифицированная процедура, описанная в работе [8]. После заключительной стадии очистки белковый препарат в течение суток диализовали против большого количества бидистиллированной воды и концентрировали на мембранном фильтре до поглощения не менее 14 -16 ОЕ280 (около 10 мг/мл). При получении кристаллических углеводных комплексов с высокими коэффициентами заполнения обоих активных центров был использован метод сокристал-лизации. К раствору белка добавляли в качестве осадителя этанол до концентрации 5 - 8% и избыток глюкозы или маннозы до концентрации около 60 мМ. После центрифугирования раствор помещали в стеклянный сосуд и выдерживали при 4°С в течение 1-2 нед до появления кристаллов. Аналогичный результат был получен при кристаллизации методом диализа относительно про-тивораствора с этанолом (6 - 10%) и углеводом (60 мМ). Полученные обоими способами кристаллы со средними размерами 0.15 х 0.2 х 0.6 мм имели, как правило, призматическую форму и хорошую огранку.
480
МИХАЙЛОВА и др.
Предварительные рентгеноструктурные исследования были проведены фотометодом на рентгеновском генераторе GX-6 (Elliott, Англия). Комплексы лектина как с глюкозой, так и с манно-зой были получены в двух кристаллических формах, дающих дифракционное поле до разрешения 1.9 - 2.3 А и отвечающих пространственной группе Р2|2,2| с параметрами элементарных кристаллических ячеек а 62.8, b 135.3, с 54.8 А и а 73.4, b 107.7, с 64.6 А. Величина удельного парциального объема в предположении одной димерной молекулы на независимую часть ячейки (Z 4) составила соответственно 2.24 и 2.46 А3/Да, что близко среднестатистическому значению для белковых кристаллов [9].
В настоящее время полученные кристаллы используются для рентгеноструктурных исследований пространственной организации углеводных комплексов с высоким разрешением.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. YarwoodA., Richardson М., Sousa-Cavada В., Rouge P. // FEBS Lett. 1985. V. 184. № 1. P. 104 - 109.
2. Rini J.M., Hardman K.D., Einspahr H., Suddath F.L., Carver J.P. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. № 14. P. 10126- 10132.
3. Van Wawe J.P., Loontiens F.G., De Bruyne C.K. // Bio-chim. et biophys. acta. 1975. V. 379. P. 456 - 461.
4. Debray H., DecoutD,, Strecker G., Spik G., Montreuil J. // Eur. J. Biochem. 1981. V. 117. P. 41 -55.
5. Rogue P., Sousa-Cavada В. II Plant Sei. Lett. 1984. V. 37. № 1. P. 21 -27.
6. Лобсанов Ю.Д., Плетнев В.З. II Биоорган, химия. 1993. Т. 19. № 1.С. 122- 125.
7. Лобсанов Ю.Д., Кузев С.В., Рискулов P.P., Рыс-кинА.И., Плетнев В.З., Мокулъский М.А. // Биоорган. химия. 1987. Т. 13. № 11. С. 1550 - 1552.
8. Trowbridge LS. И J. Biol. Chem. 1974. V. 249. № 18. P. 6004-6012.
9. Mattews B.W. HJ. Mol. Biol. 1968. V. 33. P. 423 - 441.
Preparation and Preliminary X-Ray Diffraction Analysis of New Crystalline Complexes of Pea Lectin with D-Glucopyranose and D-Mannopyranose
I. Yu. Mikhailova, I. N. Tsygannik*, Yu. D. Fonarev, Yu. V. Kulikov, and V. Z. Pletnev
Shemyakin-Ovchinnikov institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, ul. Miklukho-Maklaya 16110, Moscow, 117871 Russia
Key words: pea lectin, crystalline complex, X-ray diffraction analysis.
* To whom correspondence should be addressed.
Сдано в набор 07.03.95 г. Подписано к печати 05.05.95 г. Формат бумаги 60 х 88
Офсетная печать Усл. печ. л. 10.0 Усл. кр.-отт.4,7 тыс. Уч.-изд. л. 10.9 Бум. л. 5.0
Тираж 459 экз. Зак. 2608
Отпечатано в Московской типографии № 2 РАН, 121099, Москва, Г-99, Шубинский пер., 6
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.