БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2012, том 38, № 1, с. 72-78
УДК 577.112.6+579.69 БИОТЕХНОЛОГИЯ
получение и рефолдинг рекомбинантного маннан-связывающего лектина голотурии
APOSTICHOPUS JAPONICUS1
© 2012 г. А. А. Василенко1, С. н. Ковальчук1, 2, А. А. Булгаков1, и. Ю. Петрова3,
В. А. рассказов1
'Учреждение Российской академии наук Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН,
Владивосток 690022;
2Дальневосточный федеральный университет, Владивосток 690950;
3Учреждение Российской академии наук Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского ДВО РАН,
Владивосток 690059 e-mail: kovalchuk@piboc.dvo.ru
Статья принята к печати 26.05.2011 г.
Ранее было показано, что голотурия Apostichopus japonicus синтезирует маннан-связывающий лектин (МСЛ-AJ), обладающий уникальной специфичностью, позволяющей использовать его для обнаружения раковых антигенов. Данная работа посвящена выделению гена, кодирующего МСЛ-AJ, и его гетерологической экспрессии в клетках грамотрицательной бактерии Escherichia coli. Экспрессия МСЛ-AJ была проведена под контролем индуцируемого гена-репрессора в системе E. coli Top10/pQE-80L. Очистку рекомбинантного МСЛ-AJ осуществляли методом колоночной металло-аффинной хроматографии, после чего подбирали оптимальные условия для его ре-фолдинга. Методом иммуноферментного анализа с антителами к нативному МСЛ-AJ определены значения перекрестной иммунохимической реактивности нативного МСЛ-AJ и его рекомбинантных форм, полученных различными способами. Степень иммунохимической гомологии нативного и рекомбинантного МСЛ-AJ при оптимальном варианте рефолдинга составила 69%.
Ключевые слова: маннан-связывающий лектин, рекомбинантный белок, очистка, рефолдинг, перекрестная иммунохимическая гомология, Apostichopus japonicus, Escherichia coli.
obtaining and refolding of a recombinant mannan-binding lectin from the holothurian Apostichopus japonicus. A. A. Vasilenko1, S. N. Kovalchuk1- 2, A. A. Bulgakov1, I. Yu. Petrova3, V. A. Rasskazov1 ('Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690022; 2Far Eastern Federal University, Vladivostok 690950; 3A. V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690059)
Our previous studies have shown that the holothurian Apostichopus japonicus produces a mannan-binding lectin (MBL-AJ) possessing a unique carbohydrate specificity, which allows its use for cancer antigen detection. In the present work, we report on the isolation of the gene encoding for MBL-AJ and its heterologous expression in Escherichia coli cells. Expression of MBL-AJ was carried out under control of an inducible promoter in the E. coli Top10/pQE-80L expression system. Recombinant MBL-AJ was purified by flow-through column metal-affinity chromatography. Optimal conditions for refolding of recombinant MBL-AJ were selected. The "sandwich" ELISA method with antibody against native MBL-AJ was used to determine the values of immunochemical cross-reactivity of native MBL-AJ and its recombinant forms obtained in different ways. The extent of immunochemical homology between native and recombinant MBL-AJ obtained under optimal conditions was 69%. (Biologiya Morya, 2012, vol. 38, no. 1, pp. 72-78).
Key words: mannan-binding lectin, recombinant protein, purification, refolding, cross immunochemical homology, Apostichopus japonicus, Escherichia coli.
В современном представлении лектины - это обширная группа белков, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты гликоконьюгатов (Королев, 1984; Matsubara et а1., 2007; Tateno et а1., 2007). Это обусловлено наличием в структуре белков одного или нескольких углевод-распознающих доменов, структура которых
определяет их углеводную специфичность (Drickamer, 1988; Weis et al., 1991). В результате ранее проведенного скрининга нами впервые было показано, что в цело-мической жидкости голотурии Apostichopus japonicus (дальневосточного трепанга) содержится лектин, ин-гибируемый в реакции гемагглютинации эритроцитов О-группы крови человека низкоразветвленными ман-
1 Работа поддержана грантами ДВО РАН (№ 09-Ш-А-05-138) и Правительства РФ для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования (договор № 11.
G34.31.0010); РФФИ (№ 07-04-01247 и № 09-04-98535-Р-Восток-А), а также грантом программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная
биология" 09-1-П22-05.
ПОЛУЧЕНИЕ И РЕФОЛДИНГ
73
нанами, выделенными из морских галофильных бактерий. Данное свойство было отражено и в его названии -маннан-связывающий лектин трепанга (МСЛ-AJ). Для МСЛ-AJ определены ряд основных физико-химических свойств, биологическая роль в иммунном ответе и регенерации, получена моноспецифическая поликлональная антисыворотка, методами молекулярной биологии установлена его полная аминокислотная последовательность (Eliseikina et al., 2003, 2004; Bulgakov et al., 2007). При изучении свойств МСЛ-AJ было установлено, что необходимым условием его активности является присутствие в среде ионов Ca2+. Также было показано, что в целоми-ческой жидкости A. japonicus МСЛ-AJ существует в виде гомоолигомеров. Анализ аминокислотной последовательности МСЛ-AJ выявил наличие одного характерного домена лектинов С-типа, в том числе консервативных последовательностей, отвечающих за связывание ионов Ca2+ и маннозных остатков. На основании этих сведений МСЛ-AJ был отнесен к семейству коллекти-нов лектинов С-типа (Weis et al., 1991, 1992; Bulgakov et al., 2007). Установлено, что лектин обладает уникальной углеводной специфичностью. Его активность, в отличие от ранее изученных МСЛ позвоночных, не ингибируется стандартно используемыми моносахаридами, в частности Man, Fuc, Glc и GlcNAc (Bulgakov et al., 2007).
Вследствие уникальной углеводной специфичности лектин представляет несомненный интерес как маркер углеводных структур высокоманнозного и гибридного типов, появление которых связано с рядом патологических процессов, в частности, с развитием онкологических заболеваний (Miura et al., 1990; Maramatsu, 1993).
Низкое содержание МСЛ-AJ в целомической жидкости трепанга, а также действующий в настоящее время запрет на промысел A. japonicus не позволяют получить МСЛ-AJ в препаративных количествах из природного сырья и, соответственно, расширить спектр проводимых исследований. В связи с этим представляется целесообразной разработка методики получения рекомбинант-ного аналога МСЛ-AJ генно-инженерными методами. Для получения рекомбинантных полипептидов в настоящее время могут использоваться как прокариоти-ческие (грамотрицательные и грамположительные), так и эукариотические клетки, культивируемые в специальных условиях. Из грамотрицательных бактерий для получения рекомбинантных полипептидов широко используется Escherichia coli в силу хорошей изученности ее биохимии и генетики, простоты культивирования и разнообразия плазмидных экспрессионных векторов (Baneyx, 1999; Щелкунов, 2008).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Суммарную РНК целомоцитов голотурии Apostichopus japonicus выделяли методом кислой экстракции с использованием гуанидинтиоцианата и кислого фенола (Chomczynski, Sacchi, 1987). Суммарную кДНК целомоцитов A. japonicus получили с помощью SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit
(Clontech, США) согласно рекомендациям изготовителя. Для синтеза второй цепи и ПЦР-амплификации двухцепочеч-ной кДНК использовали набор реактивов Encyclo PCR kit (Евроген, Россия). Для амплификации фрагмента кДНК МСЛ-AJ использовали набор реактивов Encyclo PCR kit (Евроген, Россия) и ген-специфичные праймеры: Aj-5ex:(5'-TCATgc4 tg|cGCTTGTCCGGAGTTTTGGA-3') и Aj-3ex:(5'-ACGTctg c4|gCTCCAAATGATACTCGATACAG-3'). В качестве матрицы использовали суммарную кДНК целомоцитов. Обработку ПЦР-продукта и плазмиды pQE-80L (Clontech, США) эндону-клеазами рестрикции PstI и SphI осуществляли в течение 2 ч при 37°C согласно рекомендациям производителя (Fermentas, Литва).
Качественную и количественную оценку нуклеиновых кислот проводили методом гель-электрофореза в 1.2% ага-розном геле в трис-ацетатном буфере (Маниатис и др., 1984). Электрофореграммы анализировали с помощью системы анализа изображений Herolab (Германия). Длину фрагментов нуклеиновых кислот определяли, сравнивая их со стандартными олигонуклеотидами длиной от 250 до 10000 пар оснований (Сибэнзим, Россия).
Лигирование предварительно обработанных эндонукле-азами рестрикции плазмиды pQE-80L и ампликона кодирующего фрагмента кДНК МСЛ-AJ проводили Т4 ДНК лигазой (Fermentas, Литва) в соответствии с рекомендациями производителя. Трансформацию Escherichia coli плазмидной ДНК проводили методом с использованием хлористого марганца (Hanahan, 1983).
Поиск колоний E. coli, содержащих плазмиду pQE-80L со вставкой кодирующей части гена МСЛ-AJ (pQE-80L-MCT-AJ), осуществляли методом ПЦР колоний E. coli с использованием набора реактивов Encyclo PCR kit (Евроген, Россия), а также праймеров pQE-dir (5' -CGGATAACAATTTCACACAG-3') и pQE-rev (5'-AGATGGAGTTCTGAGGTCAT-3'). Выделение плазмидной ДНК из E. coli осуществляли методом щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979).
Полученная конструкция pQE-80L-WCT-AJ была проверена на отсутствие мутаций секвенированием ДНК по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977) с использованием ABI Prism Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) и праймеров pQE-dir и pQE-rev на автоматическом секвенаторе 310 (ABI PRISM, США). Полученной плазмидной конструкцией трансформировали штамм E. coli Top10. В качестве контроля использовали штамм E. coli Top10, трансформированный плазмидой pQE-80L. Трансформированные клетки выращивали в течение 16 ч при 37°C на агаризованной среде LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 15 г/л агара, рН 7.5), содержавшей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Полученные одиночные колонии инно-кулировали в 5 мл LB, содержащей ампициллин, наращивали при 37°C и постоянном перемешивании (250 об/мин) в т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.