ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 5, с. 466-474
УДК 577.152.344632.754.1633.11
ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРОТЕИНАЗ Eurygaster integriceps Put., ГИДРОЛИЗУЮЩИХ ГЛЮТЕНИН
© 2014 г. В. В. Долгих, И. В. Сендерский, А. В. Конарев
Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений РАСХН, Санкт-Петербург, 196608
e-mail: al_konarev@hotmail.com Поступила в редакцию 18.11.2013 г.
В векторы pPIC9 и pPIC3.5 были встроены кДНК, кодирующие зрелую форму глютенин-гидроли-зующей трипсиноподобной протеиназы насекомого-вредителя Eurygaster integriceps Put., обозначенной как GHP3 (glutenin hydrolyzing proteinase 3), и ее зимоген с сигнальным пептидом, ответственным за секрецию белка соответственно. Сконструированные плазмиды были использованы для экспрессии белков в клетках метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. Рекомбинантный белок, соответствующий зрелой форме протеиназы, секретировался в культуральную среду и обладал про-теолитической активностью, а зимоген приобретал активность после активирования трипсином. Оба рекомбинантных фермента гидролизовали высокомолекулярные субъединицы глютенина пшеницы сорта Ege-88 и ряда других сортов мягкой и твердой пшеницы. Показано, что ингибитор химотрипсина I из картофеля и родственные ему ингибиторы из семян растений подкласса As-teridae, ингибитор трипсина Кунитца из сои, а также апротинин быка слабо подавляли активность рекомбинантных протеиназ, в то время как ингибитор трипсина и химотрипсина Бауман-Бирк из сои не взаимодействовал с этими ферментами.
DOI: 10.7868/S0555109914040205
При поражении семян пшеницы опасный вредитель — вредная черепашка (Eurygaster integriceps Put.) — вводит в эндосперм секрет слюнных желез, содержащий пищеварительные ферменты, и затем всасывает разжиженный материал, чем наносит огромный ущерб качеству пшеницы [1—5]. При замесе теста протеиназы, оставшиеся в пораженном зерне, нарушают структуру клейковины, повреждая фракцию высокомолекулярных субъединиц белка глютенина (ВМСГ), ответственную за наиболее важные технологические качества клейковины, и ухудшают процесс хлебопечения. Коррекция качества клейковины поврежденного зерна включает добавление муки с сильной клейковиной и использование различных окислителей и других "улучшителей", некоторые из которых небезопасны для здоровья человека. При этом усложняется и дорожает производство продуктов из муки пшеницы. Изменение компонентного состава запасных белков пшеницы и применение специфических ингибиторов пищеварительных ферментов вредителей [6] можно отнести к перспективным экологически безопасным подходам к снижению потерь качества зерна. Увеличивая затраты энергии, необходимой для усвоения пищи, ингибиторы ухудшают физиологическое состояние вредителей, снижают их плодовитость и способствуют росту эффективности других защитных факторов [7—9]. При этом большинство ингибиторов протеиназ из растений не оказывают
отрицательного влияния на пищеварительную систему или физиологическое состояние человека. Известно немало примеров полезной роли ряда ингибиторов, содержащихся в пище, в частности их антиканцерогенная активность [10—12]. Ингибиторы протеиназ повышают устойчивость растений к большинству вредных насекомых и патогенов. Гены ингибиторов были успешно использованы при создании устойчивых к вредителям форм растений, особенно в сочетании с другими защитными белками [7—9]. Однако такие высокоспециализированные фитофаги, как вредная черепашка, преодолевают ингибиторный барьер за счет модификации своих ферментных систем [9, 13]. Так, протеиназы, присутствующие в поврежденном зерне, практически нечувствительны как к белковым ингибиторам, содержащимся в семенах пшеницы, так и к другим известным ингибиторам сериновых протеиназ из различных растений [14]. Таким образом, необходим поиск или создание новых форм эффективных ингибиторов таких протеиназ.
Протеиназы Е. integriceps представляют интерес и как модификаторы белков клейковины для пищевой промышленности при производстве белковых гидролизатов [15], а также для снижения токсичности клейковины для людей, страдающих опасным аутоиммунным заболеванием — целиаки-ей [14, 15]. При этом состав и биохимические свойства гидролизующих клейковину протеиназ вред-
ной черепашки остаются мало изученными. Для решения многих из перечисленных проблем необходимо наличие в достаточных количествах препаратов самих протеиназ насекомого-вредителя, выделенных из его слюнных желез или поврежденных им семян пшеницы, а также рекомбинантных ферментов, полученных методами гетерологичной экспрессии. Преимуществами последних является возможность их получения в необходимых количествах в лаборатории для последующих исследований. В нашей предыдущей работе [14] из поврежденных семян пшеницы была выделена трипси-ноподобная протеиназа (КФ 3.4.21), специфично гидролизующая высокомолекулярные субъединицы глютенина между повторяющимися гекса- и нонапептидными последовательностями. Одна из ее изоформ, обозначенная как гидролизующая глютенин протеиназа GHP3 (glutenin hydrolyzing proteinase 3), синтезируется в слюнных железах насекомого и содержит 306 аминокислотных остатков, включающих N-концевой сигнальный пептид (препептид), ответственный за секрецию белка, и зимоген, состоящий из пропептида и зрелой про-теиназы.
Цель работы — получение методом гетероло-гичной экспрессии активных рекомбинантных форм протеиназы GHP3, способных гидролизо-вать глютенин пшеницы, и изучение их свойств.
МЕТОДИКА
Нативные (природные) протеиназы выделяли из слюнных желез взрослых особей Eurygaster in-tegriceps Put. и поврежденных этим вредителем семян пшеницы, собранных в различных регионах Поволжья и Северного Кавказа [14, 16]. Для создания плазмид использовали кДНК (GenBank: HM579787.1), кодирующую протеиназу слюнных желез GHP3 [14]. Для анализа субстратной специфичности протеиназ использовали белки клейковины из неповрежденных семян пшеницы, а также рекомбинантные аналоги ВМСГ, отличающиеся по структуре повторяющихся последовательностей [17]. Белковые ингибиторы трипсина Кунитца и Ба-уман-Бирк из сои (Glycine max (L.) Merrill.), ингибитор трипсина из лимской фасоли (Phaseolus lunatus L.), ингибитор трипсина из легких быка, апротинин, производства фирмы "Sigma-Aldrich" (США) и ингибитор химотрипсина I из картофеля (Solanum tuberosum L.) - "Calbiochem" (США). Ряд ингибиторов были выделены ранее из семян различных представителей семейства Compositae и других Asteridae [18, 19]. Белки-маркеры молекулярной массы — производства "Fermentas" (Литва), и "Serva" (Германия).
Активность гидролизующих клейковину проте-иназ определяли модифицированным полуколичественным микрометодом седиментации клейковины в присутствии ДДС-Na [16]. Для определе-
ния глютенин-гидролизующей активности 1 мг муки из неповрежденных семян пшеницы инкубировали с протеиназой. Электрофорез гидролизата проводили электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС-Na в компактных Phast гелях на приборе Phast System ("Pharmacia", Швеция). Активность оценивали по степени гидролиза компонентов ВМСГ, а также их рекомбинантных аналогов [17].
Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) белков проводили на готовых пластинах геля Servalyt pre-cotes ("Serva Electrophoresis", Германия) или Phast Gels ("GE Healthcare", Швеция) в аппаратах Mul-tiphor II ("LKB", Швеция) или Phast System ("Pharmacia", Швеция) [14, 16, 20]. На гель в области анода с помощью бумажных полосок наносили 0.3—4 мкл раствора ферментов. После ИЭФ протеиназы определяли с помощью метода глю-тениновой реплики, основанного на гидролизе растворимой в уксусной кислоте фракции глютенина [16]. Для приготовления реплики к 150 г ин-тактной муки добавляли 300 мл 0.2%-ной NaCl, через 30 мин центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин и отмывали клейковину водопроводной водой. Клейковину (30 г) измельчали, добавляли 100 мл 70%-ного этанола и перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 мин. Процедуру повторяли трижды для удаления большей части глиадинов. К клейковине добавляли 150 мл 0.15 М уксусной кислоты и инкубировали на роторной качалке в течение 2 ч. Суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин. Надосадочная жидкость содержала преимущественно растворимые в уксусной кислоте глютенины. К осадку добавляли 0.15 М уксусную кислоту и процедуру повторяли дважды, получая в итоге фракции 2 и 3. В зависимости от партии муки наиболее четкие спектры протеиназ получали с использованием фракции 2 или 3. Тонкий слой глютенина на пластиковой подложке получали, как описано ранее [14, 20].
Для обнаружения протеиназ, гидролизующих глютенин, после ИЭФ белков (слюнных желез, семян или культуральной жидкости) глютенино-вую реплику смачивали 50 мМ трис-HCl буфером, pH 8.5, накладывали на разделяющий гель и инкубировали 20—40 мин при 37°C. Реплику погружали в тот же буфер и через 10 мин фотографировали в рассеянном свете на темном фоне или в проходящем свете на светлом фоне (в зависимости от партии клейковины). Компоненты протеи-наз проявлялись как светлые или темные полосы соответственно.
Препаративное ИЭФ проводили в слое гранулированного геля Ultrodex ("LKB", Швеция) в интервале pH 5.0—8.0. Отрезок геля, содержащий протеиназу, определенную с помощью глютеино-вой реплики, наносили на мини-колонку с фильтром и элюировали трехкратным (относительно
геля) объемом 0.01%-ного тритона X-100. Элюат концентрировали сухим сефадексом G-25 или в центрифужных концентраторах Centricon® ("Mil-lipore", США), пропускающих молекулы размером менее 10 кДа.
Для предварительного анализа взаимодействия протеиназ, гидролизующих глютенин, с белковыми ингибиторами был разработан новый вариант предложенного нами ранее [21] метода перекрестного анализа, в котором в качестве субстратной реплики вместо желатинового слоя фотопленки использовался тонкий слой глютенина (см. выше). На гель для ИЭФ Phast Gel 5-8 (50 х 43 мм) с помощью полоски фильтровальной бумаги (5 х 40 мм), наложенной вдоль анода на расстоянии 1 см, наносили 100 мкл препарата, содержащего анализируемую протеиназу (экстракт из поврежденных семян или культ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.