ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 6, с. 645-648
УДК 576.852.26.095.5
ПОЛУЧЕНИЕ КОБАЛЬТУСТОЙЧИВЫХ ШТАММОВ ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ -АКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ВИТАМИНА В12
© 2004 г. Э. Ä. Сейдаметова, М. Р. Шакирзянова, Д. М. Рузиева, Т. Г. Гулямова
Институт микробиологии АНРУ, Ташкент, 700128; e-mail imbasru@uzsci.net Поступила в редакцию 12.11.2003 г.
Путем адаптации к высоким концентрациям нитрата кобальта получено 46 штаммов пропионово-кислых бактерий Propionibacterium acidipropionici, обладающих устойчивостью к избытку Со2+ в среде. Изучена их способность к синтезу витамина В12 и выявлены наиболее активные культуры. Выход витамина у исходных штаммов удалось увеличить почти в 3 раза.
Витамин В12 (кобаламины) - групповое название кобальтсодержащих комплексных соединений, синтезируемых в природе лишь бактериями [1]. Многообразные биохимические функции этого витамина в организме человека являются основанием для использования его при лечении целого ряда заболеваний (различные виды анемии, гепатиты, циррозы и т.д.) [2].
Химический синтез кобаламинов очень трудоемок и длителен, поэтому использование его экономически невыгодно. С учетом того, что в промышленном масштабе витамин В12 производится исключительно микробиологическим путем [3], исследования, направленные на отбор микроорганизмов-продуцентов кобаламинов, и разработка подходов для увеличения их продуктивности являются крайне важными и перспективными.
Природные штаммы микроорганизмов ограничены контрольными механизмами от перепроизводства метаболитов, поэтому использование их в промышленных условиях является малоэффективным. В настоящее время с целью получения витамина В12 используются высокоактивные мутанты пропионовокислых бактерий [4-6]. Изучением индуцированной изменчивости пропионовокислых бактерий занимались многие авторы [7-9]. В частности, была изучена изменчивость культуры Propionibacterium shermanii под действием паров диэтил-сульфата (ДЭС), нитрозосоединений; высокоактивные мутанты были получены при использовании этиленметансульфона, диметилсульфата (ДМС) и горчичного газа [10]. Эффективным оказалось применение гидрохлорид-3-(3-хлор-4-пропоксифе-нил)5,5-дигидроимидазо(2,1-Ь)тиазола (ГХТ) [11].
Ряд исследователей полагает, что тяжелые металлы также могут оказывать мутагенное действие [12]. Наиболее общим эффектом тяжелых металлов является ингибирование синтеза белка и РНК или нарушение координации этих процессов.
По некоторым данным сверхсинтез кобаламинов пропионовыми бактериями определяется их способностью утилизировать высокие концентрации солей кобальта, относящегося к группе тяжелых металлов [7]. Способ повышения кобаламин-синтетической активности P. shermanii по признаку устойчивости к солям кобальта был успешно применен еще в шестидесятые годы XX столетия [13].
Цель работы - получение и отбор кобальтустой-чивых штаммов пропионовокислых бактерий и определение их способности к синтезу витамина В12.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили местные штаммы Propionibacterium acidipropionici Orla Jensen 1909 (П-6 и П-30), выделенные ранее в Институте микробиологии АН РУ из различных кисломолочных продуктов [14]. Штаммы выращивали в микроаэрофильных условиях (метод "овсяных свечей") [4] при температуре 30°С на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): кукурузный экстракт - 20, глюкоза - 20, (NH4)2SO4 - 3, KH2PO4 - 2, CoCl2 - 0.005, рН 6.8-7.0.
Для получения устойчивых к кобальту штаммов использовали среду, предложенную в работе [13], следующего состава (г/л): кукурузный экстракт - 10, глюкоза - 20, FeSO4 - 0.04, Co(NO3)2 -от 7.5 до 22.5. 9 мл инкубационной среды засевали 1 мл инокулята. Посевы инкубировали в термостате в микроаэрофильных условиях при 30°C от 4 до 14 сут. Затем обработанные культуры высевали в чашки Петри с агаризованной питательной средой, содержащей избыток нитрата кобальта. Отсевали колонии с измененной морфологией.
Для определения кобаламинсинтезирующей активности полученные кобальтустойчивые штаммы высевали в жидкую питательную среду со следовым количеством ионов кобальта следующего со-
646
СЕЙДАМЕТОВА и др.
кл/мл х 106 I
100
60
20
(а)
II
8
7.5
10.0
15.0
(б)
22.5 мг/мл
0
4
7
14
сут
Зависимость выживаемости пропионовых бактерий от дозы нитрата кобальта в среде (а) и времени обработки (б). Штаммы: 1 - П-6; 2 - П-30.
става (г/л): глюкоза - 20, дрожжевой автолизат - 10, кукурузный экстракт - 20, (КН4)28 04 - 3, КН2Р04 -2, СоС12 - 0.005, рН 6.8 - 7.0. Культуры инкубировали в термостате в микроаэрофильных условиях при температуре 30°С в течение 7 сут. Образующиеся органические кислоты нейтрализовали 2%-ным раствором №0Н на 3 и 5 сут. Содержание коррино-идов определяли на спектрофотометре Сф-26 ("ЛОМО", Россия) по методу Канопкайте [15]. Полученные данные представлены как среднее арифметическое из трех экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При выращивании на среде с кукурузным экстрактом в микроаэрофильных условиях при 30°С штаммы П-6 и П-30 образовывали блестящие выпуклые светло-желтые колонии.
При посеве культур, выращенных в присутствии высоких концентраций нитрата кобальта (от 7.5 до 22.5 г/л), в чашки Петри с агаризованной питательной средой были получены изолированные колонии с измененной морфологией. Морфологические типы пропионовых бактерий отличались от исходных форм размерами и окраской колоний. Кроме "карликовых" и крупных колоний были отобраны колонии с коричневыми пятнами в центре и по краям в виде каемки.
Как показали наши эксперименты, различные дозы нитрата кобальта, а также увеличение срока инкубации клеток влияли на выживаемость пропионовых бактерий. Было установлено, что процент жизнеспособных клеток в среде значительно снижался при увеличении дозы нитрата кобальта до 22.5 г/л или времени обработки до 14 сут (рисунок).
В результате однократной обработки исходных штаммов пропионовых бактерий был отобран ряд культур, как с высокой, так и с низкой активностью синтеза витамина В12. Контролем служила активность родительских штаммов: П-6 - П-19 и П-30 -П-21 мг/л (таблица). Было выявлено, что 78% полученных штаммов синтезировали витамин В12 в меньшем количестве, чем исходные культуры, а ко-бальтустойчивые штаммы П-62 и П-3032 синтезировали следовые количества кобаламинов. Наряду с этим, 10 кобальтустойчивых культур содержали значительное количество витамина. Как видно из данных, представленных в таблице, продуктивность штамма П-6 удалось повысить с 19 до 43, а П-30 -с 21 до 60.5 мг/л. Высокий выход витамина В12 сохранялся при последующих пересевах штаммов.
Среди большого числа мутагенов, использованных для получения высокопродуктивных мутантов Р. 8Нвттапи, наибольший мутагенный эффект выявлен у нитрозосоединений [5]. Так, под действием нитрозоэтилмочевины наблюдали заметную стимуляцию роста бактерий и повышение уровня синтеза витамина В12 в 3 раза [16]. В результате обработки исходной культуры К-метил-К-нит-ро-К-нитрозогуанидином, были получены активные продуценты кобаламинов, которые сохраняли свою активность в последующих генерациях [8].
Вместе с тем положительные и отрицательные варианты по признаку витаминообразования, полученные под действием нитрозометилмочевины, оказывались неустойчивыми и через несколько пассажей возвращались к исходному уровню. Морфологических мутантов при этом выявлено не было [11].
Полученные нами данные свидетельствуют, что витаминсинтезирующую активность пропионовых бактерий можно повысить без применения алкили-рующих агентов, ограничиваясь обработкой штаммов высокими концентрациями солей кобальта.
Следует отметить, что использованный нами метод получения кобальтустойчивых штаммов пропионовых бактерий ранее был успешно применен для получения мутантов Р. 8НвгтапИ [13]. Так, по признаку устойчивости к солям кобальта в среде был отобран штамм Р. 8НвгтапИ 104Ь, который продуцировал 28 мг/л витамина В12.
Проведенные нами исследования дают основание для подтверждения значения устойчивости культур к солям кобальта как одного из принципиальных факторов формирования штаммов-продуцентов кобаламинов. Под воздействием избыточного содержания нитрата кобальта нам
0
1
ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ том 40 < 6 2004
ПОЛУЧЕНИЕ КОБАЛЬТУСТОЙЧИВЫХ ШТАММОВ
647
Кобаламинсинтезирующая активность мутантов про-пионовых бактерий
Мутант Количество витамина В12
мг/г сухого веса мг/л
Исходный П-6 12.0 19.0
П-61 10.9 43.6
П-62 >2.0 >4.5
П-63 5.69 11.11
П-64 7.0 12.69
П-65 7.7 16.2
П-66 6.6 13.88
П-67 9.8 31.6
П-68 7.3 14.28
П-69 11.7 32.8
П-610 7.2 15.24
П-611 3.5 5.24
П-612 17.0 42.8
П-614 7.0 12.7
П-615 2.4 4.76
П-616 2.0 2.77
Исходный П-30 6.0 21.0
П-301 19.6 60.5
П-302 5.7 9.5
П-303 6.0 12.7
П-304 10.1 16.66
П-305 8.8 15.87
П-306 5.3 9.52
П-307 12.9 51.9
П-3011 9.4 34.4
П-3012 2.3 15.28
П-3013 11.8 42.4
П-3014 8.3 21.4
П-3015 13.8 47.1
П-3016 3.8 9.0
П-3017 7.4 12.3
П-3018 4.5 12.7
П-3019 7.1 19.7
П-3020 8.9 19.05
П-3021 2.5 13.6
П-3022 9.6 34.9
П-3023 2.6 3.17
П-3024 3.2 7.14
П-3025 3.0 7.14
П-3026 3.8 5.7
П-3027 4.7 7.14
П-3028 3.5 4.8
П-3029 6.8 7.14
П-3030 3.0 5.9
П-3031 5.3 7.14
П-3032 >2.0 >4.5
П-3033 5.5 8.25
П-3034 9.1 15.08
удалось получить штамм пропионовых бактерий, продуцирующий до 60.5 мг/л витамина; что в 3 раза выше, чем продуктивность исходной культуры.
Механизм действия солей кобальта на витамин-синтезирующую активность остается до конца неизученным. Очевидно, под воздействием токсической дозы нитрата кобальта в популяции бактерий возникают клетки, способные утилизировать высокие концентрации солей кобальта и как следствие синтезировать больше витамина В12.
Полученные данные позволяют заключить, что метод повышения кобаламинсинтезирующей активности штаммов по признаку устойчивости к солям кобальта эффективен, а полученные кобальт-устойчивые штаммы пропионовых бактерий могут являться перспективными продуцентами для получения витамина В12 в промышленном производстве.
Исследования проводили по гранту N94-02, финансируемому Фондом поддержки фундаментальных исследований
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.