УДК 57.085.23
ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ С ПОСТОЯННЫМ УРОВНЕМ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА ТАУ ЧЕЛОВЕКА И ИЗУЧЕНИЕ ТАУ-ЗАВИСИМОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ
© 2014 г. А. Н. Кленяева1*, Р. Н. Чупров-Неточин1, Е. И. Марусич1, О. Г. Татарникова2, 3, М. А. Орлов2, 3, Н. В. Бобкова3
Московский физико-технический институт, 141700, Московская обл., Долгопрудный, Институтский пер., 9;
*электронная почта: a-lina-a@yandex.ru 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 3Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3
Поступила в редакцию 12.11.2013 г.
Разработана клеточная модель для изучения фундаментальных механизмов патогенеза болезни Альцгеймера (БА). Модель представляет собой клеточную линию 3Т3-4Я-Тау, клон 47, созданную на основе родительской линии клеток ОТН-3Т3 (фибробласты мыши), постоянно экспрессирую-щую белок тау человека (формы 4Я). Стабильная экспрессия белка тау подтверждена с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклональных антител. Проведена сравнительная оценка цитотоксичности различных форм белка тау в условиях совместного культивирования клеток 3Т3-4Я-Тау с первичными нейронами гиппокампа головного мозга мыши. Экспрессия фибриллярных форм белка тау (ФФТ) показана методом вестерн-блотинга. Данные о токсическом действии человеческого белка тау, экспрессируемого клетками 3Т3, на первичные нейроны мыши могут служить косвенным подтверждением сходного сценария развития патологического процесса в мозге человека. Клеточная линия 3Т3-4Я-Тау позволяет моделировать условия, возникающие в головном мозге человека при БА и других нейродегенеративных заболеваниях более точно, чем другие клеточные модели, и может использоваться для направленного поиска лекарственных препаратов, тормозящих процессы нейродегенерации.
Ключевые слова: тау-белок, фибробласты линии 3Т3-4Я, токсические олигомерные формы белка тау, инфекционность, первичная культура нейронов.
DOI: 10.7868/S0233475514030049
Болезнь Альцгеймера (БА) приводит к полной инвалидности больного из-за развития демен-ции, которая клинически характеризуется прогрессирующей и необратимой потерей функций узнавания и поведенческими нарушениями. БА относится к наиболее частым заболеваниям у лиц пожилого и старческого возраста, а по числу случаев сопоставима с инфарктами и инсультами. Белок тау играет центральную роль в развитии наследственных и приобретенных форм возрастных деменций [1—4]. При БА в головном мозге больных обнаруживают сенильные бляшки, содержащие бета-амилоид (Ар), который образуется в результате расщепления белка-предшественника (APP), и нейрофибриллярные клубки (NFT, neurofibrillary tangles), содержащие белок тау. Отложения фибриллярных форм белка тау (ФФТ) в виде NFT или скрученных филаментов (PHF, paired helical filaments), состоящих в основном из
высокомолекулярных олигомерных форм и небольших агрегатов белка тау, часто содержат другие клеточные белки и полисахариды. Многочисленные исследования выявили существование прямой корреляции между количеством ФФТ в мозге и степенью снижения когнитивных функций, что служит доказательством ведущей роли белка тау в формировании и поддержании памяти (см., например, [4, 5]).
В норме белок тау ассоциирован с микротрубочками (МТ) и локализован главным образом в аксонах. Он принимает участие в регуляции сборки, пространственной организации и поведении МТ — основы транспортной системы в нейронах и, по-видимому, в телах глиальных клеток. Белки тау кодируются одним геном, локализованным в хромосоме 17, но в тканевых экстрактах из мозга взрослых людей найдены различные изоформы этого белка [6—8].
Гетерогенность белков тау частично обусловлена альтернативным сплайсингом их мРНК, приводящим к образованию нескольких (до шести) изо-форм в клетках головного мозга. Эти изоформы отличаются друг от друга присутствием/отсутствием вставки в положении 29 или 58 М-концевой области, а также добавлением или делецией тандем-ного повтора, который в изоформах 4Я или 3Я может быть представлен четырьмя или тремя копиями соответственно. Тандемные повторы локализованы в С-концевой области белка тау, называемой доменом связывания с МТ. Этот домен в основном состоит из повторов, которые содержат 31 или 32 остатка пролина. Самая короткая изо-форма тау-белка человека состоит из 352 аминокислотных остатков, содержит три тандемных повтора в МТ-связывающем домене и не содержит ни одной М-концевой вставки. Наибольшая изо-форма состоит из 441 аминокислотного остатка, содержит четыре повтора и обе М-концевые вставки, она названа Ы;аи40, или 4Я [6]. В данной работе изучали изоформу 4Я белка тау человека.
Начальное изменение конформации ассоциированного с МТ белка тау инициирует образование ядер, или зачатков для сборки филаментов, что является ключевым моментом формирования патологической формы (РИБ) тау. Этот процесс может зависеть от посттрансляционных модификаций белков, от мутаций или делеций определенных генов и от факторов, которые связывают нормальные белки и тем самым меняют их кон-формацию [9]. Нормальный белок тау очень гидрофилен, он легко экстрагируется из ткани мозга или культуры клеток, а филаментная форма белка тау, выделяемая при болезни Альцгеймера, является относительно нерастворимой. Нерастворимый и нормально растворимый тау различаются не только фосфорилированием, но и степенью посттрансляционных модификаций, которые включают гликозилирование, глицирование и рацемизацию [10—12]. Такие различия в физико-химических свойствах позволяют разделить эти формы тау-белка на этапе экстракции из ткани мозга человека или из рекомбинантных источников, по существу свободных от других белков, в частности от нормальных белков тау.
Сравнительно недавно было показано, что процесс фибриллизации белка тау внутри нейронов может быть инициирован под влиянием повышенного содержания токсичных олигомерных форм как амилоидного пептида (ТОФА), так и самого белка тау (ТОФТ) [13—15]. Причем ТОФА и ТОФТ, которые образуются и на внешней поверхности цитоплазматической мембраны, и внутри клеток в результате внешнего воздействия (например, в процессе их избыточного синтеза в условиях окислительного стресса), могут действовать либо аутокринным, либо паракринным путем, проникая в свои собственные или сосед-
ние здоровые клетки из внеклеточного пространства. Следовательно, существуют серьезные доказательства "инфекционности" токсических форм этих белков для здоровых нейронов. Целью данной работы было создание клеточной модели с повышенной стабильной экспрессией белка тау человека, изучение на этой модели "инфекционности" ТОФТ, а также влияния ТОФТ и ТОФА на процесс фибриллизации белка тау внутри клеток. Такая модель может быть источником как нормальной низкомолекулярной формы тау, так и токсичной плохо растворимой высокомолекулярной фракции этого белка. Использование этих белковых фракций при совместном культивировании с нейронами позволяет моделировать in vitro процесс индукции нейродегенерации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клоны стабильных трансфицированных клеток 3Т3-4Я-Тау были выделены на основе родительской линии фибробластов NIH-3T3 мыши (CRL-1658™ по каталогу ATCC), полученной из банка клеточных линий ЗАО "Исследовательский институт химического разнообразия". В работе с культурой клеток использовали питательные среды, незаменимые аминокислоты, питательные добавки и эмбриональную телячью сыворотку производства фирмы Invitrogen (США). Все остальные химические реагенты были производства фирмы Sigma (США).
Получениерекомбинантных белков тау. Реком-бинантные формы белка тау получали, используя комплект Erase a Base System (Promega, США) в соответствии с прилагаемым техническим руководством. Система основана на специфическом расщеплении встроенной ДНК экзонуклеазой III, начиная с 5'-конца. Ген белка тау клонировали в вектор рЕТ17Ь по сайтам рестрикции Ndel— EcoRI с образованием рЕТ/Т40. На 3'-конце гена находится сайт расщепления рестриктазой KpnI и три стоп-кодона во всех трех рамках считывания по ходу транскрипции после сайта KpnI. Компетентные клетки Escherichia coli DH5a трансформировали лигазными смесями образцов. Субклоны анализировали расщеплением рестриктазами PstI и Xhol, подходящие конструкции секвениро-вали, используя Т7-праймер.
Экспрессия и количественное определение рекомбинантных белков таy. Белок тау экспресси-ровали в E. coli BL21 (DE3) согласно [16]. Индивидуальные бактериальные клоны инокулирова-ли в 500 мл LB АМР (среда LB, 100 мкг/мл ампициллина). Бактериальные культуры выращивали при температуре 37°С на роторном шей-кере до ОП600 = 0.6—0.8, а затем индуцировали в присутствии 0.4 мМ IPTG. Через 3 ч бактериальные клетки осаждали путем центрифугирования при 5000 g в течение 15 мин при 4°С (центрифуга
SIGMA 6K15, ротор 12500). Осадок клеток быстро замораживали в жидком азоте и хранили при —70°С до дальнейшего использования. Для получения лизата осадок бактериальных клеток ресус-пендировали в буфере А (20 мМ PIPES рН 6.9, с добавлением 50 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 1 мМ MgSO4, 2 мМ дитиотреитола (DTT), 0.1 мМ фе-нилметансульфонилфторида (PMSF)), затем разрушали путем обработки ультразвуком на льду в течение 6 мин. Остатки клеточных стенок удаляли центрифугированиием (45000 об/мин, 15 мин, 2°С, ротор TLA-120.2, Beсkman Optima TLX). Су-пернатанты фильтровали через фильтры 0.22 мкм (Millipore, США), белок тау немедленно очищали путем ионообменной хроматографии на колонке с фосфоцеллюлозой (фосфат целлюлозы, Whatman P 11, США). После нанесения образца колонку промывали 10 объемами буфера А. Тау-бел-ки элюировали 20 мл линейного градиента NaCl (0.005-0.5 М) в 20 мМ буфере PIPES, собирали фракции объемом 1 мл.
Белок тау во фракциях идентифицировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) и последующего вестерн-блотинга, используя тау-специфические моноклональные антитела НТ7. Фракции, содержащие белок тау, объединяли и диализовали против фосфатно-солевого буфера (PBS, 3 х
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.