БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 2, с. 83-91
УДК 577.2
ПОЛУЧЕНИЕ ПРООНКОГЕННЫХ МУТАНТНЫХ ФОРМ V659E И V659Q ТРАНСМЕМБРАННОГО ДОМЕНА РЕЦЕПТОРНОЙ ТИРОЗИНКИНАЗЫ ErbB2 ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
© 2013 г. О. В. Бочарова*, Э. В. Бочаров, К. C. Минеев, М. А. Дубинный,
А. В. Мишин, А. С. Арсеньев
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; *электронная почта: o.bocharova@gmail.com Поступила в редакцию 27.07.2012 г.
Рецепторные тирозинкиназы — интегральные мембранные белки, которые активируются при латеральной гомо- или гетеродимеризации, осуществляемой с участием их трансмембранного домена. Рецепторные тирозинкиназы играют важную роль в передаче межклеточного сигнала, а полиморфизм и мутации в их трансмембранных доменах ассоциированы с рядом заболеваний человека. Семейство рецепторов эпидермального фактора роста, ErbB, представляет собой важный класс рецеп-торных тирозинкиназ, которые участвуют в процессах роста, развития и дифференцировки клеток человека. В настоящей работе для изучения влияния патогенных мутаций на структурно-динамические свойства и специфическое взаимодействие трансмембранных доменов рецепторов семейства ErbB созданы высокоэффективные системы бактериальной экспрессии и очистки рекомбинантных трансмембранных фрагментов ErbB264i-684 с проонкогенными заменами остатка Val659 на остатки Glu или Gln. Трансмембранные фрагменты нарабатывали в клетках Escherichia coli BL21(DE3)pLysS в составе гибрида с тиоредоксином А. Протокол выделения и очистки включает металлохелатную аффинную и катионообменную хроматографии. Использование тромбина для гидролиза гибридного белка позволяет снизить финансовые затраты по сравнению с аналогичными протоколами. Описанные методики позволяют получить миллиграммовые количества мутантных трансмембранных фрагментов ErbB, а также их изотопно-меченых производных для структурных исследований методом гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения в мембраноподобном окружении.
Ключевые слова: рецепторные тирозинкиназы, трансмембранный домен, рекомбинантный белок, ЯМР-спектроскопия.
Б01: 10.7868/80233475513010027
Рецепторные тирозинкиназы (РТК) занимают центральное место в регуляции роста, пролиферации, дифференцировки, адгезии, подвижности и продолжительности жизни клеток, т.е. они принимают непосредственное участие в управлении развитием и гомеостазом всех тканей человека [1, 2]. Нарушения в сигнальных РТК-системах связаны с развитием опухолей, атеросклероза, сахарного диабета, фиброзов и воспалительных процессов, сердечно-сосудистых и нейродегенера-тивных патологий, с заболеваниями скелета и поражениями соединительной ткани [3—5].
Сокращения: РТК — рецепторная тирозинкиназа; ТМ — трансмембранный; V659E/Q-ErbB2tm — ТМ-домен ErbB2641-6S4 с заменой Val659 на Glu или Gln; ИПТГ — изо-пропил-Р--0-тиогалактозид; ДМФХ — димиристоилфосфа-тидилхолин; ДГФХ — дигексаноилфосфатидилхолин; 1H-15N-HSQC — гетероядерная одноквантовая корреляция; ТФЭ — трифторэтанол; МХАХ — металлохелатная аффинная хроматография, TCEP — трис(2-карбоксиэтил)фосфин.
Молекула РТК имеет многодоменную структуру битопного мембранного белка, характерную для рецепторов типа I. Она состоит из трех основных частей: внеклеточного лиганд-связывающего домена, обеспечивающего специфичность восприятия межклеточного сигнала, трансмембранного (ТМ) альфа-спирального домена и цито-плазматического домена с киназной активностью, передающего сигнал внутрь клетки. Необходимым условием функционирования РТК является их гомо- или гетеродимеризация (как лиганд-зависимая, так и лиганд-независимая) в мембране клетки, сопровождаемая конформаци-онными перестройками и активным участием всех доменов [2, 6, 7]. Несмотря на определенные успехи в структурно-функциональных исследованиях водорастворимых внеклеточных и цито-плазматических доменов РТК, на сегодняшний день существуют только теоретические пространственные модели ТМ-доменов подавляющего
большинства РТК. Не выяснены молекулярные механизмы конформационных перестроек ТМ-доменов РТК и примембранных участков, сопровождающих активацию лиганд-рецептор-ных тирозинкиназных комплексов в мембране клетки и, в частности, в таких ее компонентах, как липидные рафты и кавеолы. Остается открытым вопрос о влиянии известных мутаций, ассоциированных с определенными заболеваниями, на структурно-динамические свойства ТМ-доме-нов РТК и их специфическое взаимодействие в мембране.
Нарушения в работе РТК, играющие важную роль в передаче межклеточного сигнала, часто ассоциированы с их повышенной киназной активностью или со спонтанной лиганд-независимой активацией рецептора. Полиморфизм и мутации в характерных димеризационных мотивах (или вблизи них) ТМ-доменов РТК прямо связаны с некоторыми патологиями человека [8, 9]. Обнаружено также, что присутствие определенных ге-теродимеров РТК в плазматической мембране характерно для различных видов раковых опухолей [1, 8—10]. Так, гомо- и гетеродимеризация РТК из семейства рецепторов эпидермальных факторов роста БгЪБ и их вариантов с мутациями в ТМ-до-мене непосредственно связаны с онкогенезом. Например, онкогенными являются мутации Уа1659С1и-ЕгЪБ2 и Уа1659С1п-ЕгЪБ2 [11], а полиморфизм 11е654Уа1-БгЪБ2 и 11е655Уа1-ЕгЪБ2 связан с предрасположенностью к раку [12]. Предполагается, что патогенные мутации стабилизируют ТМ-домен ЕгЪБ в димерной конформации, соответствующей активному состоянию рецептора даже без связывания лиганда [13—15]. Исходя из этого, на основе анализа онкогенных мутаций предположили, что полученная нами гомодимер-ная конформация ТМ-домена РТК ЕгЪБ2, диме-ризующегося посредством М-концевого характерного 004-мотива [16—19], соответствует активному состоянию тирозинкиназы ЕгЪБ. Действительно, недавно было показано [20], что данная конформация с расстоянием ~2 нм между С-концами (цитоплазматическими) ТМ-спира-лей соответствует активному состоянию тирозин-киназы ЕгЪБ, что позволяет цитоплазматическим (примембранным и киназным) доменам рецептора димеризоваться и переходить в асимметричное активное состояние для последующей передачи сигнала в цитоплазму.
Таким образом, можно заключить, что сверхактивность РТК, приводящая к различным патологиям (например, к онкологическим заболеваниям), обусловлена, по крайней мере отчасти, специфическим взаимодействием ТМ-доменов РТК в плазматической мембране. Для понимания молекулярных механизмов передачи межклеточных сигналов в норме и при патологии, а также для направленного создания новых лекарственных средств, регулирующих активность РТК, не-
обходимо знание пространственной структуры и принципов функциональной димеризации ТМ-доменов РТК и ее мутантных форм.
В настоящей работе для исследований влияния патогенных мутаций на структурно-динамические свойства ТМ-доменов ErbB и других би-топных мембранных белков созданы высокоэффективные и экономичные системы экспрессии и очистки рекомбинантных ТМ-фрагментов ErbB2641-684 (ErbB2tm) с проонкогенными заменами полярных аминокислотных остатков Val659 на Glu или Gln (далее V659E-ErbB2tm и V659Q-ErbB2tm соответственно, единое сокращение V659E/Q-ErbB2tm).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы и плазмиды. В работе использовали штаммы Escherichia coli XL-1 Blue (Stratagene, США) и BL21(DE3)/pLysS (Novagene, СШA). Плазмидная ДНК pGEMEX/TRX любезно предоставлена А.А. Шульгой (лаборатория инженерии белка ИБХ РАН).
Ферменты. В работе использовали эндонукле-азы рестрикции, Pfu-полимеразу, ДНК-лигазу фага Т4 производства Fermentas (Литва), тромбин (Технология-стандарт, Россия).
Олигонуклеотиды и секвенирование генов. Оли-гонуклеотиды синтезированы фирмой Evrogen (Москва) на установке ABI 3900 (Applied Biosystems, США). Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили в Центре коллективного пользования "Геном" (ИМБ РАН) на автоматическом секвенаторе ABI3100 (Applied Biosystems, США).
Реактивы. В работе использовали неорганические соли и органические растворители следующих фирм-производителей: Fluka (Швейцария), Sigma (США), Gerbu (Германия), Merck (Германия); бактотриптон, дрожжевой экстракт, бак-тоагар (Becton, Dickinson and Co., США); ампициллин, хлорамфеникол (Sigma, США), 15NH4Cl (Cambridge Isotope Laboratories, США), маркеры молекулярных масс белков и ДНК (Fermentas, Латвия). Для выделения ДНК из агарозных гелей и плазмидной ДНК использовали наборы фирмы QIAGEN (США).
Липиды. Для создания мембраноподобного окружения использовали дигексаноилфосфати-дилхолин (ДГФХ, Avanti Polar Lipids, США) и ди-миристоилфосфатидилхолин (ДМФХ, Sigma, США).
Хроматографические колонки и смолы. Ni-хе-латирующая сефароза, катионообменная смола SP Sepharose Fast Flow производства GE Healthcare Bio-Sciences (Швеция).
Конструирование экспрессионных плазмид pGEMEX/TRX-V659E/Q-ErbB2tm. Плазмидные конструкции были получены на основе вектора pGEMEX/TRX [21, 25, 26]. Матрицу для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодирующих трансмембранные фрагменты, собирали при помощи ПЦР с использованием фланкирующих праймеров. Перед генами V659E-ErbB2tm и V659Q-ErbB2tm вводили сайты узнавания энтерокиназой и тромбином соответственно. Ген тиоредоксина амплифицировали с использованием вектора pGEMEX/TRX, включая сайты узнавания протеиназами. Полученные в результате двух ПЦР продукты рекомбинировали, гид-ролизовали эндонуклеазами рестрикции RsrIl и BamHI (сайты узнавания которых находились в середине гена TRX и на З'-концах обоих генов ErbB2tm соответственно) и лигировали с обработанным теми же рестриктазами вектором. ДНК выделенных клонов анализировали с помощью ПЦР и секвенировали в пределах вставки.
Препаративная экспрессия pGEMEX/TRX-V659E/Q-ErbB2tm. Клетки штамма E. coli BL21(DE3)/pLysS трансформировали плазмидным вектором pGEMEX/TRX-V659E/Q-ErbB2tm, высевали на чашку Петри с ампициллином и хлорам-фениколом в концентрации 35 и 100 мкг на 1 мл среды с агаром и инкубировали при 37°С в течение ночи. Культуру клеток инокулировали свежими колониями из расчета одна колония на 1 мл среды М9 или TB. Культуру выращивали в колбах
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.