МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 5, с. 790-799
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.2.08,616-006.04,616-035.7
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ СЕРПИНОВ В3 И В4 И ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С АНТИТЕЛАМИ НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
© 2015 г. В. И. Бутвиловская1, М. В. Цыбульская1, А. А. Тихонов14, В. О. Талибов1, П. В. Белоусов2, А. Ю. Сазыкин2, А. М. Шварц1, Л. В. Путляева1, С. А. Суржиков1, А. А. Стомахин1, О. Н. Солопова3, А. Ю. Рубина1*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119234 3Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, Москва, 117638 4Высший химический колледж Российской академии наук, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, 125047
Поступила в редакцию 19.11.2014 г. Принята к печати 27.02.2015 г.
Цель настоящей работы — получение рекомбинантных антигенов плоскоклеточных карцином (серпинов В3 и В4) и изучение их взаимодействия с различными моноклональными антителами на гид-рогелевом биологическом микрочипе (биочипе). Для этого созданы кодирующие эти антигены нуклео-тидные конструкции и получены полноразмерные рекомбинантные белки серпин В3 (8РВ3) и серпин В4 (8РВ4), содержащие Н18б-группы на Оконце. Были наработаны моноклональные антитела Н3, С5, Н5, Н81 и G9 против серпина В3. Создан биочип, в различных ячейках которого иммобилизованы антитела против 8РВ3, коммерческие моноклональные антитела 8СС107 и 8СС140 к белку, который вырабатывается клетками плоскоклеточного рака — 8ССА, а также рекомбинантные белки 8РВ3 и 8РВ4. На основании их специфичного связывания с моноклональными антителами против 8ССА, которые, по данным производителя, распознают конформационные эпитопы как 8РВ3, так и 8РВ4, сделан вывод о том, что полученные серпины В3 и В4 обладают правильной третичной структурой. Прямой иммуноанализ на биочипе показал, что 8РВ4 эффективно связывается только с антителами 8СС107 и 8СС140, тогда как 8РВ3 специфически взаимодействует как с этими антителами, так и с моноклональными антителами Н3 и С5. При использовании сэндвич-анализа на биочипе обнаружена пара антител — 8СС107/С5, которая специфично взаимодействует только с 8РВ3 и не взаимодействует с 8РВ4. Таким образом, мы показали возможность селективного определения на биочипе серпина В3 в присутствии гомологичного ему серпина В4.
Ключевые слова: антиген плоскоклеточной карциномы, SCCA, серпин В3, серпин B4, биологический микрочип, иммуноанализ.
PREPARATION OF RECOMBINANT SERPINS B3 AND B4 AND STUDY OF THEIR SPECIFIC INTERACTIONS WITH ANTIBODIES USING HYDROGEL-BASED MICROARRAYS, by V. I. Butvilovskaya1, M. V. Tsybulskaya1, A. A. Tichonov1'4, V. O. Talibov1, P. V. Belousov2, A. Yu. Sazykin2, A. M. Schwartz L. V. Putlyaeva 1, S. A. Surzhikov1, A. A. Stomakhin1, O. N. Solopova3, A. Yu. Rubina1* (1 Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia, *e-mail: isinfo@eimb.ru; 2 Department of Biology, Moscow State University, Moscow, 119234 Russia; 3Russian Research Center for Molecular Diagnostics and Therapy, Moscow, 117638 Russia; 4Higher Chemical College, Russian Academy of Sciences, Mendeleyev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, 125047 Russia). The mail goal of our work was preparation of recombinant squamous cell carcinoma antigens (serpins B3 and B4) and investigation of their interaction with different monoclonal antibodies using hydrogen-based microarrays (biochips). Two constructs encoding full-length serpin B3 (SPB3) and serpin B4 (SPB4) have been created for the preparation of the two recombinant proteins with His6-taq on the N-terminus. Monoclonal antibodies against serpin B3 (H3, C5, H5, H81 and G9) have been also obtained. An experimental gel-based biological microchip has been created. Biochip contained gel elements with immobilized antibodies against SPB3, gel elements with immobilized commercial monoclonal antibodies against SCCA SCC107 and SCC140, and gel elements with immobilized SPB3 or SPB4. The conclusion about the correct folding of produced recombinant serpins B3 and B4
* Эл. почта: arubina@biochip.ru
was made on the basis of their specific binding with monoclonal antibodies against SCCA, which, according to the manufacturer data, can recognize conformational epitopes of both SPB3 and SPB4. The results of biochip-based direct immunoassay demonstrated that SPB4 binds effectively only with SCC107 and SCC140 antibodies while SPB3 specifically interacts both with these antibodies and with H3 and C5 monoclonal antibodies. Using sandwich biochip-based immunoassay we have found a pair of monoclonal antibodies SCC107/C5 which interacts specifically with serpin B3 but does not interact with serpin B4. Thus, we have demonstrated the possibility of selective determination of serpin B3 in the presence of highly homological serpin B4 using biochips.
Keywords: squamous cell carcinoma antigens (SCCA), serpin B3, serpin B4, biological microchip, immunoassay. DOI: 10.7868/S0026898415050043
Антигены плоскоклеточной карциномы сер-пин B3 (другие названия — Protein T4-A, антиген 1 плоскоклеточной карциномы, SCCA1, SPB3) и серпин B4 (Leupin, Peptidase inhibitor 11, антиген 2 сквамозных клеток карциномы, SCCA2, SPB4) относятся к семейству овальбуминовых серпи-нов, эндогенных ингибиторов протеаз, и проявляют себя как "суицидные ингибиторы", угнетающие действие протеаз с различной субстратной специфичностью [1, 2]. Они гомологичны по своему нуклеотидному и аминокислотному составу на 98 и 92% соответственно. Специфичность ин-гибирующей активности серпинов обусловлена различием в аминокислотной последовательности в пределах RSL-петли (Reactive Site Loop) [3, 4]. Серпин B3 ингибирует папаиноподобные цисте-иновые протеазы (химотрипсин и катепсины S, K, L), а серпин B4 — как сериновые (катепсин G и химаза тучных клеток), так и цистеиновые проте-азы [5—8].
Повышение экспрессии серпинов B3 и B4 при злокачественных опухолях различной локализации (шейки матки, легких, головы и шеи, печени, молочной железы, толстой и прямой кишок, поджелудочной железы) [9—13] способствует росту злокачественных клеток путем ингибирования апоптоза [14—16]. По уровню содержания серпи-нов можно предсказать стадию развития заболевания, глубину инвазии, статус лимфатических узлов, период выживаемости, риск развития рецидива и реакцию на радиотерапию [17—20]. Следовательно, выбранные нами для исследования серпины B3 и B4 служат маркерами целого ряда патологий и могут быть включены в перечень диагностических сигнатур для раннего выявления широкого круга онкологических заболеваний.
В некоторых случаях бывает важно определять серпины B3 и B4 по отдельности. Например, при раке молочной железы наблюдается сверхэкспрессия только гена серпина B4 [21]. При раке легкого, сопряженном с идиопатическим фиброзом, синтезируется только серпин B4 [22], а при неоадъювантной химиотерапии мелкоклеточного рака легкого фиксируется повышение уровня только серпина B3 [23]. Повышение уровня синтеза серпина B4 наблюдается в опухолевых тканях
гипофиза, простаты, легкого, менингиомы, при воспалительных заболеваниях кишечника [13], а также в панкреатической жидкости при раке поджелудочной железы [24]. В тканях гепатобласто-мы [25] и холестеатомы [26] экспрессируется преимущественно серпин В3.
На данный момент коммерчески доступные тест-системы предназначены, в основном, для определения суммарного содержания серпинов В3 и В4. Задача раздельного определения этих серпинов в ходе одного анализа может быть решена с помощью мультиплексного анализа биологических образцов на биочипах [27—30].
В данной работе нами показана принципиальная возможность дифференциального определения серпина В3 в присутствии серпина В4 на гидрогелевом биочипе с иммобилизованными моноклональными антителами против серпинов В3 и В4.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты. Использовали поливиниловый спирт (70—100 кДа), поливинилпирролидон (360 кДа), Tween-20 и Сефадекс® G-25 coarse ("Sigma-Ald-rich", США), Bind Silane и N-гидроксисукцини-мидный эфир флуоресцентного красителя циа-нинового пятого (Су5, "Amersham- Pharmacia-Biosciences", США), хроматографические колонки Micro Bio-Spin ("Bio-Rad Laboratories", Франция), стеклянные подложки Corning ("Corning 2947 Micro Slides", США).
Оборудование. Использовали робот QArray ("Genetix", Великобритания), лампу ультрафиолетового света с максимумом излучения 350 нм ("Sylvania GTE lamp", F15T8/350B1, Великобритания), термостат инкубационный на 37°С ("Binder", США), спектрофотометр DU 730 ("Beckman Coulter", США), центрифугу Eppendorf 5417R ("Eppendorf", Германия), термостат-инкубатор 2DG ("Thelco", США), микропланшетный фотометр Anthos 2020 ("Anthos Labtec Instruments", Австрия), MALDI-TOF-масс-спектрометр AB Sciex 4800 ("AB Sciex", США).
Получение и характеристика рекомбинантных серпинов. Полноразмерные рекомбинантные серпины B3 (390 АА, хромосомная локализация 18q21.3; идентификатор базы данных UniProt P29508-1) и B4 (390 АА, хромосомная локализация 18q21.33; идентификатор базы данных UniProt P48594-1) получали в виде слитных белков с фрагментами, кодирующими Н^б-группы на N-конце. Смесь кДНК нескольких B-лимфобла-стоидных линий, полученную при помощи обратной транскрипции с олиго(ёТ)-праймером, использовали для амплификации полноразмерных кодирующих последовательностей серпинов B3 и B4 при помощи ПЦР с геноспецифическими оли-
гонуклеотидными праймерами. Для дискриминации высокогомологичных последовательностей генов БЕКРШБЗ и БЕКРШБ4 использовали следующий подход. Геноспецифичная часть одного из праймеров полностью комплементарна участкам последовательностей обоих серпинов (Serpin_Fwd 5'-TTTAGGA Т ШСАССАТОААТТСАСТСАОТО-З'), в то время как второй, дискриминирующий, праймер уникален для каждого из них. Эта специфичность определялась вставкой из трех неидентичных, отличающихся в обоих серпинах, нук-леотидов в З'-конце ка
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.