БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № I, с. 28 - 32
УДК 57.037:577.152.351*52.01
получение специфических субстратов гликопептидамидазы а и кинетика их €1>ерментативного гидролиза
© 1995 г. Е. Н. Калиберда*, Л. Д. Румш
Институт биоорганический химии им. И.И. Шемякина и 10.А. Овчинникова РАН, Москва. 117871, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 22.12.93 г. После доработки 04.06,94 г.
Гликопептиды были получены последовательными пепсиновым (гликононапептид) и трипсиновым (гликогексапептид) гидролизами овальбумина. Описана методика (ВЭЖХ) определения активности гликопептидамндазы А с использованием флуоресцентно меченных (Эпв) гликопептидов. Определены кинетические константы гидролиза специфических субстратов гликопептидамидазой А. Показано, что предпочтительным субстратом гликопептидамндазы А является гликогексапептид 0^-Туг(Оп5)-А5п(СНО)-Ьеи-ТЬг-8ег-Уа!.
Ключевые слова: гликононапептид, гликогексапептид из овальбумина, кинетика гидролиза, гликопептидамидаза А.
Гликопептидамидаза А из сладкого миндаля (КФ 3.5.1.52, пептид-1Ч4-(Ы-ацетил-|3-1>-глюкоз-аминил)-£-аспарагин-амидаза) была выделена и охарактеризована в нашей лаборатории ранее [1]. Важным моментом ее тестирования и изучения кинетических параметров является получение ее специфических субстратов. В качестве источника потенциальных субстратов этого фермента был выбран овальбумин, который имеет одну ГЯ-оли-госахаридную цепь. Сначала овальбумин подвергали обработке пепсином [2], затем полученный продукт гидролиза (рис. 1, отмеченный пик) расщепляли трипсином [3]. Необходимо отметить, что после гидролиза как пепсином, так и трипсином (см. ниже) первичное фракционирование реакционной смеси осуществляли на биогеле Р-4 для отделения протеиназ, балластных пептидов и солей перед ВЭЖХ. При этом фракции, содержащие гликопептиды, обнаруживали по их углеводной детерминанте модифицированным фенол-сернокислотным методом [4]. Дальнейшее разделение гидролизатов на индивидуальные гликопептиды проводили методом ВЭЖХ в обращенной фазе (рис. 1 и 2, 'Экспериментальная часть").
При разделении углеводсодержащей фракции пепсинового гидролиза га овальбумина методом ВЭЖХ в обращенной фазе гликопептид элюиру-ется в пике 1 (рис. 1) с временем удержания около ! 8 мин. Секвенированием определена структура пеп-
Сокращения: СНО - олигосахаридная часть; Огв-5-диметил-аминонафталин-1-сульфонат; АМК - 7-амино-4-метилку-марин; I I Щ - гликононапептид, ГГП - гликогексапептид. ♦Автор для переписки.
тидной части, Glu-Ghi-Lys-Tyr-Xaa-Leu-Thr-Ser-Val, соответствующая аминокислотной последовательности 290 - 298 в овальбумине: Ghi-GlibLys-Tyr-Asn(CHO)-Leu-Thr-Ser-Val [5]. Следовательно, неидентифицированная при секвенировании аминокислота является аспарагином, к которому присоединены гликаны. Гликопептид содержит Man и GicNAc в соотношении 5.7 : 1.8, что позволяет отнести его углеводную цепь к олигоманно-зидному типу [5]. Мы не изучали углеводную последовательность N-гликана, поскольку тестирование активности гликопептидамндазы А проходило по другому продукту ферментативной реакции - пептиду.
На следующем этапе работы часть выделенного гликононапептида (ГНГ1) обрабатывали трипсином с тем, чтобы отщепить N-концевой трипеп-тид [3]. После гель-фильтрации на биогеле Р-4 трипсинового гидролизата углеводсодержащую фракцию хроматографировали на Ultrasphere С8 и получили гликогексапептид (рис. 2, заштрихован) с аминокислотной последовательностью Туг-Хаа-Leu-Thr-Ser-Val.
Для повышения чувствительности метода тестирования ферментативной активности выделенные. гликопептиды (ГНП и ГГП) обрабатывали д а} i сил х л о р 11 до м (Dns), чтобы ввести флуоресцентную метку. Необходимо подчеркнуть, что дансили-рование проводили с использованием литий-карбонатного буфера (рН 9.5) и отношения ацето-нитрил - вода 1 : 2 (обратного классическому), поскольку, как следует из работы [6], в этих условиях подавляются разложение г л и к о- Г) n s - пептид о в
ПОЛУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ
Рис. 1. Разделение продуктов пепсипового гидролиза овальбумина методом ВЭЖХ на колонке Ultrasphere Cg (4.6 х 250 мм) в условиях градиента концентрации 0.1% TFA, 0% CH3CN - 0.05% TFA, 75% CH,CN (40 мин, скорость эяюции 1.5 мл/мин). Отмечена выделяемая фракция.
и образование Dns-NH2. Поскольку 100-кратный избыток Dns-Cl не является обязательным условием полноты дансилирования [6], был использован 5 - 10-кратный мольный избыток реагента в расчете на гликопептид. В указанных условиях дансилирования ГНП содержал три дансильные группы: Dns-Glu-Glii-Lys(Dns)-Tyr(Dns)-Asn(CHO)-Leu-Thr-Ser-Val, а ГГП - две дансильные группы: Dn.s-Tyr{Dns)-Asn(CI-IO)-Leu-thr-Ser-Va]. После дансилирования гликопептиды хорошо сохраняются в сухом виде в темном стекле при 4°С. Оценку количества полученных даисилированных глико-пептидов проводили методом ВЭЖХ в обращенной фазе сравнением с определенным количеством Dns2-Lys для Dns3-FHn и с Dns2-Tyr для DnSj-ГГП. Подбор указанных даисилированных аминокислот, взятых в качестве внутреннего стандарта при анализе ВЭЖХ реакционной смеси, был проведен эмпирически. Для этого мы добивались максимального совпадения количества флуоресценции 5 нмоль дансилированного гликопептида, определенного по аминокислотному анализу, с таким же количеством даисилированных аминокислот: Dns2-Tyr, Dns2-Lys и Dns-Glu. Соответствующие пары гликопептид-аминокис-лота отмечены выше.
Для определения ферментативной активности гликопептидамидазы А проводили инкубацию
ГЛИКОПЕПТИДАМИДАЗЫ А 29
Рис. 2. Разделение продуктов трипсинового гидролиза гликононалептида овальбумина (рис. 1, выделенный пик) методом ВЭЖХ на колонке ШгаБрИеге С8 (4.6 х 250 мм) в 10 мМ фосфатном буфере (рН 2.0) в градиенте концентрации ацетонитрила 0 - 70% (40 мин, скорость элюции 1.5 мл/мин). Отмечена выделяемая фракция.
10 нмоль Ош3-ГНП с гликопептидамидазой А в течение 2 ч, а затем анализировали продукты реакции ВЭЖХ (рис. 3). Анализ продукта реакции (пик 2, рис. 3) показал отсутствие углеводов, в то же время аминокислотный состав пептида оставался прежним. Пш3-нонапептид образовался в результате отщепления олигосахарида гликопептидамидазой А, а не был продуктом действия экзогли-козидазных или протеолитических ферментов. Аналогично определяли активность фермента с Опк2-ГГП. Удельная активность фермента составила с Опй3-ГНП 52, с Ппя2-ГГП 130 нмольДмин мг).
При гидролизе обоих субстратов гликопептидамидазой А установили, что оптимальное соотношение Е : Б равно 1 : 200. При этом ферментативная реакция за 2 ч с Опз2-ГГП проходила на 90, с Опвз-ГНП на 60% (рис. 4), несмотря на то что стадия насыщения фермента субстратом в обоих случаях достигается уже через 1 ч. Отмечалось небольшое ингибироваиие гликопептидамидазы А Опб3 ГНП: реакция в течение длительного времени инкубации (4 - 6 ч) проходит только на 60%. Однако при добавлении новой аликвоты такого же субстрата наблюдается его расщепление, что подтверждает сохранение активности гликопептидамидазы А. При уменьшении указанных соотношений (Е : 8 = 1 : 50 (100)) реакция проходила за 2. ч на 50% с Оп52-ГГП и на 20% с П^-ГНП.
30
КАЛИБЕРДА, РУМШ
0.5
к к й я а) У
л Я
ir 4 о-ен
Рис. 3. Анализ методом ВЭЖХ (иИгаэрЬеге С18, 4.6 х х 250 мм) Опвз-ГПП (а) и продукте»! ег о гидролиза глпкопептидамидазой А (б): / - Опх3-ГЫП, 2 -Цпвз-НЛ. Условия: 10% изопропамол-0.1% ТРА в градиенте ацетонитрила 0 - 45% (30 мин).
Рис. 4. Кинетика образования продуктов (Р) гидролиза глнкопептидамидазой А Dnsi-ГГП (Л и Dnsj-FHIl (2),
[1/V] х 103, мин/мМ
0.3 / 2 _ SfJCT 1
0.2
/ ^^ 0.1 i i
-"-lo' -5 5 10
[1/S] х 10-\ мМ
Рис. 5. Определение кинетических констант реакции гликопептидамидазы А с Ог^-ГГЛ (/) и Пий^-ГИП (2) по методу Лайнуивера-Берка.
При определении кинетических параметров гидролиза гликопеггпщов гликопептидамидазой А концентрации обоих субстратов и фермента изменяли, как указано в таблице. Необходимо также отметить, что при изучении кинетики ферментативного гидролиза субстратов методом ВЭЖХ были изменены условия анализа: градиент ацето-
нитрила 10 - 50% s течение 60 мин. Указанное изменение приводило к улучшению разделения и детекции продуктов ферментативной реакции при низких количествах (1.5-2 нмоль) исходного субстрата в пробе. Для указанного диапазона концентраций субстратов зависимость в координатах Лайнуивера-Берка для этого фермента была линейной и представлялось возможным определение Кт и Vmax (рис. 5). Кт для Dns3-rHn (115 мкМ) окзалась несколько большей, чем Кт для Dns2-rrn (78 мкМ), что характеризует лучшее связывание гликопептидамидазы А с последним субстратом (см. таблицу). При анализе кинетических данных, полученных в этой работе, можно отметить, что L3¡ для Dns2-lTn в 2 раза больше, чем ксм для Dns^-FUII. Такое превышение ксм при меньшей К., для Dns2-rrn дает отношение ксМ/Кт выше в 3.4 раза по сравнению с таковым для Dns3-FHn, что характеризует большую специфичность фермента к Dns2-rm.
При сравнении полученных нами результатов кинетических параметров ферментативного гидролиза глико-1)п8-пептидов с аналогичными данными для радиоактивно меченного глико-(ДЮш^-октгшептида [7] из овальбумина следует отметить совпадение Кт 150 мкМ [7] с соответствующей величиной для Dns3-rHn (Кт 115 мкМ). Здесь необходимо оговорить, что приведенные в таблице ксм и V'iraj из статьи [7] были нами рассчитаны из описанных в ней условий ферментативной реакции. Совпадение Кт для глико-(3HDns2) -октапептида и Dns3-I НП подтверждает отсутствие влияния дансильных групп на связывающую способность фермента. Каталитическая константа гликопептидамидазы А в реакции гидролиза глико-Оп83-октапептида, равная 102 мин-1 [7], превышает наши данные /сса( для Dnsrrm (в 12 раз) и для DnsrrHn (в 30 раз, таблица). В работе [7] использовали гликонеп-тид из овальбумина, полученный последовательными расщеплениями бромцианом и трипсином 293 ' 300
Туг -Asn(CHO)-Leu-Thr-Ser-Val-Leu- Hse . N-Глика-ны у всех глихопептидов были олигоманнозид-ного типа. По-видимому, отсутствие дипептида Leu-Hse на С-конце Dns2-rrn (295 - 298) существенно для проявления к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.