МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 430-432
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.481.11.017-254
ПОЛУЧЕНИЕ Ш5-ИНДУЦИРОВАННЫХ МУТАНТОВ ПЛАЗМИДСОДЕРЖАЩЕГО ШТАММА-ДЕСТРУКТОРА НАФТАЛИНА И САЛИЦИЛАТА PSEUDOMONAS PUTIDA BS394(pBS216) С ИНГИБИРОВАНИЕМ РОСТА НА РАЗЛИЧНЫХ СУБСТРАТАХ ПРИ ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ
© 2004 г. В. Г. Грищенков*, Ä. Ä. Радзион**, П. Ä. Медведев*, М. И. Балина**, Ä. М. Воронин*
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино ** Пущинский государственный университет Поступила в редакцию 19.01.04 г.
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), такие, как нафталин, фенантрен, би-фенил, пирен и др. относятся к классу полиядерных ароматических соединений, повышенный интерес к которым со стороны экологов обусловлен их высокой токсичностью, устойчивостью к разложению и/или канцерогенностью [1]. Поскольку ПАУ относятся к широко распространенным загрязнителям, и при этом значительная часть пространства на Земле подвержена воздействию низких температур (постоянно или сезонно), понятен возрастающий интерес к изучению их микробной деструкции при пониженных температурах.
Известно, что биодеструкция различных ксенобиотиков (например, н-алканов, моно- и полициклических ароматических углеводородов и др.) может осуществляться в широком диапазоне температур [2, 3]. В ряде случаев, например, в случае деградации нафталина и его интермедиата - салициловой кислоты способность штаммов-деструкторов проводить указанный процесс в сильной степени зависит от температуры инкубирования [4]. Тот факт, что гены деградации нафталина у бактерий рода Pseudomonas часто обнаруживаются в составе конъюгативных плазмид, позволяет исследовать экспрессию катаболических генов в различном хозяйском окружении, в том числе в психрофильных микрооганизмах. Кроме того изучение характера деградации ПАУ (на примере модельного субстрата - нафталина), осуществляемой бактериями при низкой температуре, позволит выявить генетические и биохимические факторы клетки, участвующие в обеспечении низкотемпературной утилизации ксенобиотика. Одним из подходов к такому изучению является получение транспозон-индуцированных негативных мутаций и последующая их идентификация [5, 6].
В настоящей работе приводятся данные по получению in vivo Jn-индуцированных температуро-
чувствительных мутантов у штамма-деструктора нафталина и салицилата P. putida BS394 (pBS216) с использованием двухкомпонентной системы, разработанной Симоном и соавт. [7]. Данная система состояла из двух компонентов: специального штамма донора Escherichia coli S17-1 со встроенными в хромомсому tra-генами плазмиды широкого круга хозяев - RP4 и векторной плазмиды E. coli pSUP2021, содержащей в своем составе "mob''-гены (гены мобилизации) плазмиды RP4 и транспозон Tn5, несущий признак Kmr . Наличие таких tra и mob-генов RP4 в E. coli обеспечивало передачу вектора pSUP2021 в клетки бактерий других видов, в которых однако его стабильное существование было невозможно, вследствие чего и происходила его элиминация. Спасение маркера Tn5 в этом случае происходило за счет его встраивания в хромосому или резидентную плаз-миду нового хозяина.
В результате были получены Ктг-трансконъ-юганты штамма BS394(pBS216) (c частотой возникновения 10-6/клеток донора). Появление му-тантного фенотипа, характеризовавшегося инги-бированием роста клеток при пониженных температурах, происходило примерно у 1% таких Kmr клонов. При этом наблюдалось три типа му-тантных фенотипов (табл. 1).
Первый тип (строка 1) - характеризовался ин-гибированием роста как на нафталине и салици-лате, так и на глюкозе при пониженной температуре. Второй тип мутантов (строка 2) демонстрировал еще более полное ингибирование роста при пониженной температуре, заключавшееся в неспособности к росту и на полноценной следе - LA. Третий тип мутантов (строка 3) по своим ростовым характеристикам при низкой температуре не отличался от таковых при 28°С, но характеризовался реверсией к прототрофности.
ПОЛУЧЕНИЕ 7Ш-ИНДУЦИРОВАННЫХ МУТАНТОВ 431
Таблица 1. Распределение по группам Тп5-индуцированных мутантов штамма ББ394 (рБ8216) с ингибированием роста на различных средах при низкой температуре
28°С 8°С
Группа Е среда Е среда
нафта- салици- глюко- Kmr L среда нафта- салици- глюко- Kmr L среда
лин лат за лин лат за
1 + + + + + - - - - +
2 + + + + + - - - - -
3 + + + + + + + + + +
Контрольные 394 - - + - + - - + - +
штаммы 394 (pBS 216) + + + - + + + + - +
Примечание. Рост на твердых агаризованных средах оценивали по росту газона клеток и отдельных колоний, как описано ранее [4]. Регистрацию роста культур проводили через 2 сут в случае выращивания при 28°С и через 7 сут при инкубировании культур при 8°С.
Таблица 2. Распределение по группам трансконъюгантов штамма BS228 (Ade ) в зависимости от характера роста на селективных средах при низкой температуре
Условия получения Ростовые характеристики*
трансконъюгантов 28°С 8°С
Группа Е среда Е среда
Селективная среда Частота появления нафталин салицилат глюкоза rm K L среда нафталин салицилат глюкоза rm K L среда
I II III Нафталин Km Нафталин Km Нафталин Km 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 <10-9 + + + + + + + + + + + + + + + + + - + +
Контрольные штаммы 394 394 (pBS 216) - - + + + + - + + + + + + - + +
* См. примечание к табл. 1.
С целью локализации встройки транспозона (плазмида-хромосома) была проведена серия скрещиваний ряда мутантных клонов из первой и второй групп штамма BS394(pBS216) со штаммом BS228 (Ade). Как следует из данных, приведенных в табл. 2, было получено несколько типов трансконъюгантов при их отборе на различных селективных средах: нафталине (маркере плазмиды биодеградации) и канамицине (маркере Tn5).
Один тип характеризовался ингибированием роста при пониженных температурах на нафталине, салицилате и глюкозе (I группа, табл. 2). Другой тип характеризовался ингибированием роста при пониженной температуре на всех тестируе-
мых субстратах, включая и ЬА (II группа, табл. 2). Следует отметить что у трансконъюгантов как первого так и второго типа присутствовал маркер транспозона Тп5 - Кшг, который передавался с частотой, сопоставимой с частотой передачи маркера нафталиновой плазмиды. Другими словами, указанные мутантные фенотипы наследовались клетка-ми-трансконъюгантами, получившими плазмиду деградации нафталина и маркер Кшг из исходных мутантов.
У следущего типа трансконъюгантов отсутствовало ингибирование роста при пониженных температурах на тестируемых субстратах и также отстутствовал маркер Кшг (III группа, табл. 2). Из
МИКРОБИОЛОГИЯ том 73 < 3 2004
432
ГРИЩЕНКОВ и др.
чего было сделано предположение, что мутантный фенотип в исходных мутантах штамма ББ630, был обусловлен скорее всего встраиванием Тп5 в бактериальную хромосому.
Для получения дополнительных данных, свидетельствовавших бы в пользу того, что в ряде случаев мутантные фенотипы обусловлены присутствием в клетках плазмиды деградации нафталина рББ216 со встроенным в нее транспозоном Тп5, у некоторых из мутантных штаммов-транс-конъюгантов, полученных на основе ББ 228 (мутанты А4 и 41 из II группы и 56 из I, табл. 2), была осуществлена элиминация плазмиды с помощью митомицина С [8]. В результате такой процедуры клетки-"элиминанты" утратили не только маркеры плазмиды рББ216, но и маркер Тп5 - Кшг. При этом у них восстанавливалась способность к росту на глюкозе и полноценной среде (в случае с А4 и 41) при 8°С. Более того, при введении в такие штаммы-элиминанты соответствующих плазмид-ных ДНК (выделенных предварительно из мутантных штаммов А4, 41 и 56) клетки-трансформанты с приобретением плазмид и маркера Кшг, восстанавливали мутантный фенотип ингибиро-вания роста при 8°С. Подобный эффект наблюдался и у трансформантов, полученных на основе "дикого" штамма ББ228 при его трансформации соответствующей плазмидной ДНК (данные не приводятся).
Таким образом, можно констатировать, что в результате работы впервые получены мутации плазмидной локализации, обуславливающие ингибиро-вание роста бактерий-хозяев при пониженной температуре как на селективных средах - нафталине и салицилате, так и дополнительно на глюкозе (мутант 56), катаболизм которой, как известно, обусловлен хромосомными детерминантами, а так же и на полноценной среде (мутанты А4 и 41).
Дальнейшее, более детальное изучение этих плазмидсодержащих мутантов как на биохимическом, так и на молекулярно-биологическом уровнях позволит выявить биохимические и генетические факторы, ответственные за рост бактерий на различных субстратах при низкой температуре.
Работа финансировалась РФФИ (проект № 0204-48985), МНТС (грант № 2366) и Российской федеральной целевой научно-технической программой "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники", государственный контракт 43.073.1.1.2502.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sutherland J.B., Rafll F., Khan A., Cerniglia C. Mechanisms of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation // Microbial transformation and degradation of toxic organic chemicals. 1995. P. 269-306.
2. Whyte L.G., Bourbonniere L., Greer C.W. Biodegradation of petroleum-hydrocarbons by psychrotrophic pseudomonas strains possessing both alkane (Alk) and naphthalene (Nah) catabolic pathways // Appl. Environ. Microbiol.1997. V. 63. № 9. P. 3719-3723.
3. Mohn WW, Westerberg K, Cullen W.R., Reimer K.J. Aerobic Biodegradation of biphenyl and polychlorinat-ed-biphenyls by arctic soil-microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. № 9. P. 3378-3384.
4. Грищенков В.Г., Шишмаков Д.А., Кошелева И.А., Воронин A.M. Рост бактерий-деструкторов нафталина и салицилата при пониженных температурах // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 3. С. 322-328.
5. Kevin P., O'Connell, Gustafson A.M., Lehmann S.M., Tomashow M.F. Identification of cold shock gene loci in Sinorhizobium meliloti by using a luxAB reporter trans-poson // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. № 1. P. 401-405.
6. Chablain PA, Zgoda A.L., Sarde CO., Truffaut N. Genetic and molecular orga
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.