ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 5, с. 517-521
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 636.52/58:57.089.36
ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ КУР С ГЕНОМ ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ОПОСРЕДОВАННОГО ГЕННОГО ПЕРЕНОСА С ПОМОЩЬЮ
СПЕРМАТОЗОИДОВ © 2013 г. А. В. Самойлов***, А. З. Кесян**, Н. М. Сураева***
*Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности Россельхозакадемии, 142703 Московская обл., Видное, ул. Школьная, 78 **Институт биологии развития им. Н.Е. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 *** Научно-исследовательский институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического центра им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478Москва, Каширское ш., 24
E-mail: als_83@mail.ru Поступила в редакцию 12.09.2011 г.
Методом искусственного осеменения трансфицированными сперматозоидами с применением препарата для трансфекции "Lipofectamin® 2000" получена трансгенная птица с геном гранулоцитар-ного колониестимулирующего фактора (gcsf) человека. Доля трансгенных цыплят с геном gcsf 'человека в общем числе выведенных составила 33.3%. Показано, что концентрация белка G-csf человека в сыворотке крови трансгенных особей варьировала от 50 до 220 пкг/мл. В результате осеменения трансгенных кур спермой нетрансгенных петухов получено первое поколение трансгенной птицы, при этом наследование чужеродного гена отмечалось у 37.5% полученных цыплят.
DOI: 10.7868/S0002332913040140
С развитием методов введения ДНК в организм и культивируемые клетки животных появилась возможность создания моделей для фундаментальных и прикладных научных исследований генной регуляции процессов эмбриогенеза и онтогенеза в норме и при патологии. Одно из важных направлений связано с созданием трансгенных животных, используемых в качестве продуцентов рекомбинантных фармацевтических белков (Сураева, Самойлов, 2009).
Первые результаты трансгенеза у млекопитающих были получены в опытах на мышах в начале 1980-х гг. Было показано, что экзогенная ДНК, введенная методом микроинъекции в пронуклеус зиготы, может быть интегрирована в геном мыши (Gordon et al., 1980). Однако использование указанного метода для создания трансгенных домашних животных (свиней, овец, коз, коров) оказалось малоэффективным. Только 10—17% трансплантированных микроинъецированных зигот приживались и менее 1% их них давали трансгенное потомство (Pinkert, Murray, 1999). Кроме таких нежелательных последствий процедуры микроинъекции, как гибель эмбрионов на различных стадиях развития и невысокая эффективность трансгенеза, отмечается также определенный дефицит эмбриологического материала сельскохозяйственных животных и необходимость применения высокотехнологичного оборудования, об-
служиваемого квалифицированным персоналом. Все это препятствует широкому использованию данного метода.
Трансгенные птицы по сравнению с млекопитающими характеризуются потенциальными возможностями широкомасштабного производства за счет быстрого размножения исходных трансгенных особей, высоким уровенем экспрессии экзогенных белков, их правильным гликозилиро-ванием и посттрансляционными модификациями в организме трансгенных кур, низкой стоимостью производства (Ivarie, 2003). Однако большинство трансгенных продуцентов с высоким титром лекарственных белков было получено с использованием вирусных векторных конструкций (Kamihira et al., 2005), что не исключало возможности риска нежелательной активации про-тоонкогенов в организме (Li, Lu, 2010).
Трансгенез с помощью сперматозоидов, как и перенос генов с помощью вирусов, не требует больших финансовых затрат, однако исключает использование вирусов (Chang et al., 2002). Разработка технологии введения чужеродного гена путем переноса со сперматозоидами открывает широкие возможности по использованию куриных яиц для продукции фармацевтических белков.
Число сообщений об удачных попытках интеграции экзогенной ДНК и ее передачи следующим поколениям трансгенной птицы неуклонно
518
САМОЙЛОВ и др.
растет (Wang et al., 2001; Chang et al., 2002; Harel-Markowitz et al., 2009; Collares et al., 2011). Оказалось, что липосомы, моноклональные антитела и другие переносчики генетической информации значительно повышают эффективность встраивания чужеродных генов в хромосомы. Поэтому на начальном этапе нашей работы была поставлена задача подбора препарата для трансфекции, который обеспечил бы эффективное хромосомное встраивание и наследование чужеродного гена.
Настоящее исследование было направлено на получение трансгенной птицы с геном gcsf человека методом опосредованного генного переноса с помощью сперматозоидов и изучение возможности наследования и экспрессии данного гена в целях создания трансгенной популяции сельскохозяйственной птицы для получения рекомби-нантных белков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве вводимой чужеродной ДНК использовалась плазмида на основе вектора pIR.ES EGFP2 (С1оп1есИ, США), любезно предоставленная нам С.И. Городецким. В полилинкер вектора pIRES EGFP2 был проклонирован ген gcsf человека.
Для проведения трансфекции сперматозоидов готовили одновременно два раствора: к 300 мкл среды ОРТ1-МЕМ (1пук1^еп, США) добавляли 60 мкг плазмидной ДНК и к 300 мкл среды ОРТ1-МЕМ — 60 мкл препарата липосом "Ыро-1ес1атт® 2000"(1пу111^еп). Растворы инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем их объединяли и инкубировали также при комнатной температуре 20 мин.
Получив сперму петухов, ее разбавляли в соотношении 1 : 3 средой ОРТ1-МЕМ, после чего оценивали качество семени (Давтян, 1999). Для опыта отбирали 500 млн. сперматозоидов на одно осеменение. Семенную жидкость удаляли путем двукратного центрифугирования (220 g, 5 мин), отбора супернатанта и разбавления осевших сперматозоидов средой ОРТ1-МЕМ в 1 мл. После второго центрифугирования и отбора суперна-танта к сперматозоидам добавляли комплекс ДНК и "Ь1ро1ес1ат1п® 2000", перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Далее осуществляли искусственное осеменение кур.
После осеменения кур трансфицированными сперматозоидами собирали яйца, инкубировали их в течение 7 или 21 сут в инкубаторе для яиц, извлекали эмбрионы или получали цыплят. Было осеменено 6 кур, собрано 40 яиц и получено 9 эмбрионов и 6 цыплят.
Идентификацию интеграции экзогенной ДНК осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). На разных стадиях экспериментов биологическим материалом для выделения ДНК служили как ткани полученных эмбрионов, так и цельная кровь полученных цыплят. К выделенным эмбрионам добавляли 500 мкл раствора PBS (ООО "НПО ПанЭко", Россия), гомогенизировали и отбирали 100 мкл гомогената для выделения ДНК с помощью Набора для универсальной пробоподготовки (ООО "Лаборатория ИзоГен", Россия).
ДНК из цельной крови цыплят получали с помощью набора реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови человека (ООО "НПФ Синтол", Россия). При использовании данного набора кровь птицы на начальных стадиях выделения образовывала труднорастворимый сгусток из-за большого содержания фибриногена в плазме и ядер в эритроцитах, что затрудняло дальнейшее выделение ДНК. Для преодоления возникшей проблемы при заборе крови мы использовали вакуумные пробирки VACUETTE® (Австрия) с добавлением гепарина, троекратно разбавляли кровь раствором PBS (ООО "НПО ПанЭко") и центрифугировали. Выделенная ДНК в обоих случаях либо сразу использовалась для проведения ПЦР, либо хранилась при температуре —20°С.
С помощью компьютерной программы Vector NTI были подобраны праймеры для проведения ПЦР. Для определения гена gcsf использовали "прямой" (5' CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG) и "обратный" (5' GCC TGC AGG AGC CCC TGG TAG AGG) праймеры. Реакцию проводили с применением наборов для ПЦР "GenPak® PCR Core" (ООО "Лаборатория ИзоГен"), реакционный объем составлял 50 мкл. ПЦР проводили с использованием амплификатора "Терцик™" (НПО "ДНК-Технология", Россия), по следующей программе: 95°С в течение 5 мин, 95°С — 20 с, 68°С - 20 с, 72°С - 20 с. в течение 30 циклов и 72°С в течение 1 мин за 1 цикл. При этом положительным контролем служила плазмида pIRES EGFP2 со встроенным геном gcsf человека, а отрицательным - ДНК нетрансгенной птицы. Продукты ПЦР разделяли электрофоретическим методом в 2%-ном агарозном геле, в буфере ТВЕ с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 30 нг/мл и визуализировали в ультрафиолетовом свете.
Экспрессию белка G-csf у трансгенной птицы определяли в сыворотке крови, которую получали из подкрыловой вены с использованием вакуумных пробирок VACUETTE®. Далее кровь обрабатывали согласно инструкции VACUETTE® по получению сыворотки крови, а именно: проводи-
ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ КУР
519
Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК, выделенной из тканей (а) и крови (б) куриных эмбрионов, полученных в результате эксперимента по переносу гена gcsf человека с помощью сперматозоидов, а также выделенной из крови цыплят, полученных от трансгенных куриц (в). а: 1 — отрицательный контроль; 2 — ДНК из тканей нетрансгенного эмбриона; 3—11 — ДНК из тканей эмбрионов, полученных в результате эксперимента; 12 — положительный контроль. б: 1—7 — ДНК из крови цыплят, полученных в результате эксперимента; 8, 9 — ДНК из крови не-трансгенных цыплят; 10, 11 — отрицательный, 12 — положительный контроль. в: 1—8 — ДНК из крови цыплят, полученных от трансгенных кур; 9, 10 — ДНК из крови нетрансгенных цыплят; 11 — положительный, 12 — отрицательный контроль.
(а)
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
(б)
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
(в)
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
ли центрифугирование пробирок с кровью (1500 g, 10 мин при 5°С).
Концентрацию G-csf определяли с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа "Human - G-csf" (Kat №KHC2031) производства фирмы "Invitrogen".
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эффективность использования препарата на основе липосом "Lipofectamin(r) 2000" при получении трансгенной птицы методом опосредованного переноса чужеродной ДНК с помощью сперматозоидов оценивали по числу полученных трансгенных эмбрионов. Три из девяти полученных эмбрио
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.