ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 6, с. 833-843
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1
ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ С ГЕНОМ HvNHX3 И ОЦЕНКА ИХ УСТОЙЧИВОСТИ К ЗАСОЛЕНИЮ
© 2014 г. А. Б. Кривошеева*, Т. В. Варламова**, Н. О. Юрьева*, Г. И. Соболькова*,
В. П. Холодова*, Д. В. Беляев****
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Всероссийский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, Москва ***Московский физико-технический институт, Долгопрудный, Московская обл. Поступила в редакцию 03.03.2014 г.
Одним из подходов к изучению механизмов солеустойчивости растений является трансформация генами различных ионных транспортеров, в частности генами вакуолярных NHX-антипортеров. В данной работе ген вакуолярного NHX-антипортера ячменя HvNHX3 ввели в растения картофеля (Solanum tuberosum L.) двух сортов: Юбилей Жукова и Скороплодный-7. Для трансформации сконструировали бинарный вектор pCambia-HvNHX3, несущий ген HvNHX3 и маркерный ген устойчивости к канамицину NPTII (каждый под контролем конститутивного 35S промотора вируса мозаики цветной капусты). В 35 из 48 устойчивых к канамицину трансформантов подтвердили интеграцию целевого гена HvNHX3 и наличие транскрибируемой мРНК. Оценку ростовых показателей 13 трансгенных линий проводили в контрольных условиях и на среде с повышенным содержанием NaCl. Ростовые параметры и солеустойчивость трансгенных линий картофеля более устойчивого сорта Юбилей Жукова остались на уровне нетрансформированных растений исходного сорта. Введение гена HvNHX3 в сорт Скороплодный-7 в контрольных условиях повышало биомассу и длину побега у большей части исследованных линий. В отличие от нетрансформированных растений трансгенные растения сорта Скороплодный-7 укоренялись и росли на 100 мМ NaCl, что может свидетельствовать об их большей солеустойчивости.
Ключевые слова: Solanum tuberosum — вакуолярный NHX-антипортер — солеустойчивость — генетическая инженерия
Б01: 10.7868/80015330314060116
ВВЕДЕНИЕ
Засоление почв является одним из наиболее распространенных по площади и неблагоприятному воздействию на продуктивность растений абиотических стрессоров [1]. Выяснение механизмов адаптации растений, позволяющих им выживать в условиях засоления среды, является важным направлением физиологии устойчивости растений.
Высокий уровень ионов натрия или высокое отношение №+/К+ в цитоплазме инактивируют большое число ферментативных реакций темно-вой фазы фотосинтеза и дыхания, синтеза белка и полисахаридов [1, 2]. Вакуолярные МИХ-транс-портеры переносят ионы из цитозоля в ваку-
Адрес для корреспонденции: Кривошеева Александра Борисовна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: positive.melody@mail.ru
оль в обмен на ионы Н+, что позволяет растениям в условиях солевого стресса снизить токсическое действие в цитозоле, а также использовать в качестве осмолита в вакуоли для обеспечения более низкого водного потенциала клетки [3].
Вакуолярные МИХ-антипортеры были первоначально описаны в растениях как Ма+/И+-анти-портеры [4], позднее было показано, что они осуществляют также К+/И+-обмен на тонопласте благодаря движущей силе протонного градиента, который создают Н+-АТФаза У-типа и Н+-пиро-фосфатаза [5].
В ячмене были идентифицированы четыре изоформы МИХ-антипортера: ^МИХ1 [6], Ш:ЫИХ2 [7], ШМИХЗ [8] и ИМИХ4 [9]. Эти гли-кофосфопротеины содержат гидрофобную область на М-конце, которая встраивается в тоно-пласт, и длинный гидрофильный "хвост" на С-конце, который обеспечивает взаимодействие
с другими белками. Ранее с помощью методов иммуноцитохимии и Вестерн-блот анализа мы показали, что изоформы HvNHX2 и HvNHX3 присутствовали в одних и тех же клетках ячменя, и количество белка этих антипортеров в ответ на солевой стресс увеличивалось в растениях устойчивого к засолению сорта ячменя [10].
Аминокислотная последовательность
HvNHX3 идентична на 96% последовательности Na+/H+-антипортера HbNHXl дикорастущего ячменя (Hordeum brevisubulatum), который отличается высокой устойчивостью к различным абиотическим стрессорам, включая засуху, засоление и щелочность почвы [8]. В связи с этим было высказано предположение о возможном повышении солеустойчивости трансгенных растений при экспрессии в них гена HvNHX3.
Целью данной работы стала экспрессия трансгена HvNHX3 в растениях картофеля сортов Юбилей Жукова и Скороплодный-7 и оценка устойчивости к засолению полученных трансгенных линий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовали бактерии Escherichia coli штамма DH5a и Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0. Использовали pGEM®-T вектор ("Promega", США) и бинарный модифицированный вектор pCambia2300 с геном устойчивости к канамицину ("Cambia", Австралия).
Клонирование кДНК HvNHX3. На основе кодирующей последовательности гена HvNHX3 (Генбанк, № DQ372061), сконструировали пару праймеров с искусственно введенными сайтами рестрикции BamHI и SalI для дальнейшей амплификации кДНК: 5'-TCGAAGGTCGACGGATC-CA(A/C)AATGGGGTTGGGGCTGGG-3' и 5'-GTACACGTCGACGCTAGCTTACTAGTTCT-CACTTCCATGGGC-3'.
Тотальную РНК выделяли из корней семидневных проростков ячменя солеустойчивого сорта Эло с помощью реагента Trizol ("Invitro-gen", США). Синтез кДНК проводили, используя обратную транскриптазу M-MuLV ("Fermentas", Литва). Далее кодирующую область гена вакуолярного антипортера HvNHX3 длиной 1620 п.н. амплифицировали с использованием Pfu ДНК полимеразы ("Сибэнзим", Россия). Первоначальную денатурацию проводили при 95°C в течение 3 мин, последующие 30 циклов амплификации: 30 с при 95°C, 30 с при 60°C и 2 мин при 72°C, окончательная элонгация — при 72°C в течение 3 мин. Амплифицированный фрагмент кДНК HvNHX3 очищали и клонировали в pGEM®-T вектор. Соответствие амплифициро-ванной нуклеотидной последовательности под-
твердили секвенированием в обоих направлениях трех независимых клонов.
Для дальнейшей работы выбрали один клон, из которого фрагмент кДНК HvNHX3 переклонировали в модифицированный вектор pCam-bia2300 по сайтам BamHI/Sali. Отсутствие нарушений в нуклеотидной последовательности кДНК HvNHX3 при переклонировании проверили путем секвенирования фрагментов вектора pCambia-HvNHX3, содержащих 5'- или 3'-концы кДНК HvNHX3 и прилегающие к ним соответствующие участки нуклеотидной последовательности вектора.
При конструировании вектора pCambia-HvN-HX3 плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса ночной культуры E. coli. Расщепление ДНК проводили при помощи различных эндонуклеаз рестрикции в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками ("Сибэнзим"; "Fermentas"). Лигирование осуществляли при помощи Т4 ДНК лигазы ("Силекс", Россия). Качество и количество выделенных препаратов оценивали аналитическим электрофорезом в 1% ага-розном геле на приборах модели Sub-Cell GT WIDE MINI ("Bio-Rad", США). Элюцию фрагментов ДНК проводили из легкоплавкой агарозы или при помощи набора для очистки ДНК ("Fermentas").
Введение вектора в агробактерию. Конструкцию pCambia-HvNHX3 вводили в агробактери-альный штамм AGL0 по протоколу "triparental mating" [11]. Клоны трансформированной агро-бактерии штамма AGL0 проверяли с помощью ПЦР на наличие вставки гена HvNHX3 и генов вирулентности Vir.
Трансформация растений картофеля и условия их выращивания. Трансгенные формы получали методом агробактериальной трансформации экс-плантов листа или стебля картофеля (Solanum tuberosum L.) сортов Скороплодный-7 и Юбилей Жукова по модифицированному протоколу для трансформации и регенерации растений картофеля [12]. Отбор трансформантов осуществляли на среде MS с добавлением 50 мкг/мл канамиц-инсульфата. Растения трансгенных линий и контрольные растения выращивали на среде для черенкования (соли MS, 1 мг/л пиридоксина, 1 мг/л тиамина, 20 г/л сахарозы, 0.7% агар) в климатической камере при температуре 22—24°C, влажности 75%, освещенности 8 клк и 16-часовом фотопериоде.
Подтверждение трансгенной природы полученных линий. Тотальную ДНК картофеля выделяли методом со CTAB. Обнаружение наличия трансгена HvNHX3 в трансформированных растениях проводили методом ПЦР с прямым Hv3-685U (5'-GGGCTTCTCAGTGCTTATG-3') и обратным Hv3-1325L (5' - GCCTCGCTGGAATCAGTA- 3')
BamHI (9153)
Т-граница" (левая)
35S poly(A)
N
!■ ^ 35S pro i
SalI (10794)
35S poly(A)
^ 114 Т-граница (правая)
NPTII
HvNHX3
pCambia-HvNHX3
Рис. 1. Генетическая конструкция pCambia-HvNHX3.
HvNHX3 — целевой ген HvNHX3; NPTII — ген неомицинфосфотрансферазы, селективный ген устойчивости к антибиотику канамицину; 35S pro — 358-промотор вируса мозаики цветной капусты; BamHI и Sail — сайты рестрикции.
праймерами. Длина амплифицированного фрагмента составляла 640 п.н. Праймеры подбирали с использованием программы Oligo ("Molecular Biology Insights, Inc."). ПЦР проводили в объеме 25 мкл в амплификаторе Терцик ("ДНК-технология", Россия) по следующей программе: первоначальная денатурация — 2 мин при 94°С, затем 30 циклов амплификации ПЦР, состоящей из трех последовательных реакций: 1 мин денатурации при 94°С, 1 мин отжига праймеров при 53°С и 1 мин элонгации при 70°С, затем завершающий синтез 10 мин при 70°С. Состав реакционной смеси: 50 нг геномной ДНК картофеля, 50 мМ KCl, 10 мМ Tris—HCl (pH 8.3), 1.5 мМ MgCl2, 200 мкМ dNTPs, 1.25 е.а. Taq ДНК полимеразы и по 25 пмоль каждого праймера.
Выделение РНК и ОТ-ПЦР. Суммарную РНК выделяли из листьев растений картофеля феноль-ным методом и обрабатывали RNase-free DNase I ("Fermentas") для удаления геномной ДНК. Для обратной транскрипции гена HvNHX3 использовали 1 мкг РНК с генспецифичным обратным праймером Hv3-1325L и обратной транскрипта-зой M-MuLV в соответствии с инструкциями изготовителя ("Fermentas"). Последующую ПЦР проводили с генспецифичными праймерами и условиями амплификации, как для геномной ПЦР. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле в 0.5х TAE буфере.
Анализ устойчивости к повышенному содержанию соли. Трансгенные растения к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.