МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 398-405
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 574.3+479.852.11.[088+047]
ПОЛУЧЕНИЕ ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННЫХ ДИССОЦИАНТОВ НЕКОТОРЫХ БАЦИЛЛ И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА DIR-ПЦР
ДЛЯ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ
© 2004 г. С. В. Цыганкова*, Е. С. Булыгина*, Б. Б. Кузнецов*, С. С. Хабибулин **, Е. В. Дорошенко***, Е. В. Коротков*, Г. И. Эль-Регистан ***
*Центр "Биоинженерия" РАН, Москва **Российский химико-технологический институт им. Д.И. Менделеева, Москва ***Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 28.07.03 г.
Впервые предложены приемы быстрого получения и генотипической идентификации фенотипиче-ских (колониально-морфологических) диссоциантов бактериальных культур. Для проявления потенциальной фенотипической способности и выделения диссоциантов рекомендован рассев цисто-подобных рефрактерных клеток (ЦРК) бактерий. Эти клетки характеризуются нестабильностью фенотипа и при их рассеве в первом пассаже наблюдается резкое увеличение индекса диссоциации с выщеплением клеток, дающих различающиеся фенотипическими признаками колонии. Разработанные приемы апробированы на примерах Bacillus свгем, B. subtilis и B. licheniformis, у которых выделены колониально-морфологические диссоцианты различных типов в первом пассаже при рассеве на плотные питательные среды цистоподобных клеток, полученных в циклах развития бактериальных культур и в результате искусственного повышения в среде роста аутоиндукторов анабиоза. Оценку внутригеномных различий диссоциантов B. cereus и B. subtilis проводили с помощью поли-меразной цепной реакции с использованием системы праймеров, разработанных на основе полных геномов прокариот, представленных в базе данных GenBank (DIR-ПЦР). Применение предложного метода позволило выявить минорные отличия в структуре геномов диссоциантов B. cereus и B. subtilis, что подтверждает гипотезу, согласно которой в основе механизма диссоциации бактерий на субпопуляции лежат обратимые внутригеномные перестройки.
Ключевые слова: бациллы, фенотипические диссоцианты, покоящиеся формы, геномные фингер-принты, ПЦР, олигонуклеотидные праймеры.
Диссоциация бактерий заключается в одновременном существовании в популяции клеток, образующих при дальнейшем их делении варианты, которые различаются по ряду колониально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических характеристик и способных к взаимозаменяемости с высокой частотой (10_2-10г4 на одно клеточное деление) [1, 2]. Согласно современным представлениям популяционная вариабельность бактерий обусловлена процессами внутригеном-ной рекомбинации генетического материала клетки, которые можно отнести к специфическому типу мутаций [3]. Хотя это явление описано для многих бактерий различных таксонов, эндогенная причинность популяционной диссоциации, приводящая к адаптивной смене фенотипов, неизвестна. В появившихся в последние десятилетия экспериментальных работах отмечается повышение фенотипической гетерогенности популяции в стационарной фазе роста, в стареющих и длительно хранящихся микробных культурах [2, 4]. Согласно ряду гипотез это связано с состоянием пролиферативного покоя клеток, с включени-
ем общего регулона стационарной фазы [5] и действием сигнальных молекул, контролирующих переход клеток к состоянию покоя и экспрессию генов стационарной фазы [6, 7].
Интерес к проблеме внутрипопуляционной изменчивости микроорганизмов и возможностям ее контроля постоянен. Особенно он возрос в последние годы, поскольку обозначились новые подходы к изучению фенотипической изменчивости как генетического феномена, лежащего в основе таких явлений и процессов как изменение скорости микробных синтезов и трансформаций, вирулентность и персистенция патогенных и условно-патогенных бактерий, результативность симбиозов и замещение продуктивных вариантов промышленных штаммов. Поэтому оценка потенциальной способности бактериальных культур к диссоциации, выделение субпопуляций, их идентификация и характеристика на молекулярном уровне является актуальной. Использование таких популярных подходов, как картирование генома, анализ нуклеотидных последовательностей 168 рРНК или межгенной области 168-238
рРНК, как правило, не дает ожидаемых результатов при исследовании штаммов близкородственных микроорганизмов, а также при изучении внутривидовых структурных перестроек генома прокариот. В последнее время для изучения близкородственных микроорганизмов используют методы генотипирования, или геномной дактилоскопии, которые основаны на интегральных способах характеристики генома и не требуют выявления его полной молекулярной организации. Они позволяют определять различия между близкородственными микроорганизмами, не выявляемые другими методами. Существует большое разнообразие таких методик: КРЬР, АР-ПЦР, ЯАРБ-ПЦР, БАЕ-ПЦР, АБЬР, гер-ПЦР, ЕМС-ПЦР [8]. Они основаны на амплификации "случайных" областей ДНК-матрицы с использованием одного или нескольких олигонуклеотид-ных праймеров, специфичных для той или иной области геномной ДНК прокариот. В результате таких реакций амплифицируют спектр ПЦР-фрагментов различной длины. Получаемые ДнК-фингерпринты являются уникальными и позволяют выявлять полиморфизм между микроорганизмами на разных таксономических уровнях, включая видовой. Однако большинство таких подходов не обладают высокой специфичностью на уровне штаммов. Поэтому требуются новые системы, способные надежно различать филогенетически близкие штаммы прокариот.
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы являлось: 1) описание приемов быстрого выявления широкого спектра фенотипических (колониально-морфологических) диссоциантов бактерий на примерах В. евтвт, В. 8ыЬйШ и В. ИсНет/от-т1з\ 2) исследование возможности применения метода БШ-ПЦР для идентификации выделенных внутривидовых субпопуляций и оценки вариабельности их геномов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы и условия культивирования.
Объектом исследования служили бактерии Bacillus cereus, штамм 504 (ВКМ), Bacillus subtilis, штамм 720 (ВКМ), которые хранили на скошенном картофельном агаре, а также Bacillus licheni-formis, штамм 103 - мясопептонном агаре.
Для получения покоящихся форм бацилл использовали среды различного состава. Основной солевой состав (г/л): (NH4)2HPO4 - 1.0; KCl - 0.2; MgSO4 ■ 7H2O - 0.2; CaCl2 - 0.2; FeCl3 ■ 6H2O -0.001; MnSO4 ■ H2O - 0.0017. Среда № 1 (для эндо-спорообразования): основной солевой состав, МПБ - 20%, глюкоза - 0.2%. Среда № 2 (для получения цистоподобных рефрактерных клеток -ЦРК при дисбалансе С/N): основной солевой состав, дрожжевой автолизат - 0.2 г/л, глюкоза -
6-20 г/л. Среда № 3 (для получения ЦРК в условиях лимита по N): основной солевой состав, где заменены (NH4)2HPO4 и KCI на K2HPO4 - 1 г/л и мочевину - 0.08 г/л; глюкоза - 1.6%. Значения pH во всех средах после стерилизации составляли 7.0 ± 0.2. В качестве инокулята использовали 5-6-суточ-ную суспензию эндоспор, которые вносили в количестве, дающем начальную плотность клеточной суспензии 0.2 ("Specord", X = 600 нм, l = 10 мм). Культивирование проводили в колбах на 250 мл (объем среды 50 мл) при температуре 28°С и встряхивании на качалке со 140 об/мин. ЦРК под действием факторов d1 получали их внесением в суспензию клеток фазы замедленного роста как описано ранее [7]. Оценку вариабельности проводили высевом ЦРК Bacillus subtilis на картофельный агар, B. licheniformis на агаризованную среду, содержавшую мясопептонный бульон и сусло (1 : 1) (БСА).
Выделение ДНК. Препараты ДНК из указанных выше штаммов микроорганизмов выделяли, как описано ранее [9].
ПЦР-фингерпринтинг. Амплификацию геномной ДНК проводили на приборе Cetus 480 ("Perkin Elmer", Швеция) с использованием следующих праймеров: KRPN1 - 5'-TCIIAAGCTTCA-3'; KRPN2 -5'-CGCCIGGIGGAT-3', где I - inosine. Оптимизация условий ПЦР была выполнена согласно методике Taguchi [10]. Объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав: 1х буфер полимеразы BioTaq (17 мМ (NH4)2SO4, 6 мМ mpuc-HCl, pH 8.8, 6 мМ MgCl2), 5 нМ dNTP, 50 нг ДНК-матрицы, 12.5 пМ каждого праймера и 1.25 ед BioTaq DNA Polymerase ("Диалат ЛТД", Россия). Температурно-временной профиль: первичная денатурация - 94°С х 3 мин; последующие 35 циклов - 94°С х 30 с, 37°С х 40 с и 72°С х 1 мин; и 7 мин при 72°С для окончательной элонгации. Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле, содержавшем бромистый этидий, при напряженности поля 6 В/см. Для документации результатов элект-рофоретического разделения продуктов ПЦР использовали систему гель-документации BioDocII ("Biometra", Германия).
Амплификацию ДНК с использованием праймеров к мобильным элементам IS50 [11], P150: 5'-GAGGAC AACGGTTC-3' и тPtРНK: 5'-CTAC-CAGRSSCACCA-3' [Игнатов, неопубликованные данные] проводили в таких же условиях, за исключением состава 1х буфера полимеразы BioTaq: 17 мМ (NH4)2SO4, 6 мМ mpuc-HCl, pH 8.8, 2 мМ MgCl2.
Выбор праймеров и оптимизация проведения
DIR-ПЦР. С помощью ранее разработанного алгоритма [12] был проведен анализ 87 полных геномов микроорганизмов, представленных на тот момент в базе данных Genebank. Это позволило
400
ЦЫГАНКОВА и др.
создать набор универсальных олигонуклеотид-ных праймеров, способных выявлять незначительные изменения в геномах близкородственных бактерий. Для работы было отобрано 24 праймера. Проверку этих праймеров, а также подбор оптимальных условий для DIR-ПЦР проводили на диссоциантах B. cereus и B. subtilis.
Амплификация, выделение и свенирование 5'-концевой области гена 16S рРНК. Амплификацию проводили с использованием универсальных праймеров на приборе Cetus 480 ("Perkin Elmer", Швеция) с применением термостабильной поли-меразы BioTaq ("Диалат ЛТД", Москва) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для амплификации использовали универсальные прайме-ры: 11-27F - 5'-GTTTGATCMTGGCTCAG-3' (прямой) и 530R - 5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3' (обратный) [13]. Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл - 94°С х 3 мин, 50°С х 2 мин и 72°С х 3 мин; последующие 30 циклов - 94°С х 30 с, 50°С х 30 с и 72°С х 30 с и затем 72°С х 7 мин для
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.