МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 678-688
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.2:616-006.6:575
ПОНИЖЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА OGDHL АССОЦИИРОВАНО С ГИПЕРМЕТИЛИРОВАНИЕМ ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ПРИ
КОЛОРЕКТАЛЬНОМ РАКЕ
© 2015 г. М. С. Федорова1, #, А. В. Кудрявцева1, 2, #, В. А. Лакунина1, А. В. Снежкина1, Н. Н. Волченко2, Е. Н. Славнова2, Т. В. Данилова2, А. Ф. Садритдинова1, 2, Н. В. Мельникова1, А. А. Белова1, К. М. Климина3, Д. В. Сидоров2, Б. Я. Алексеев2, А. Д. Каприн2,
А. А. Дмитриев1, 2, Г. С. Краснов1, 4, *
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Минздрава России,
Москва, 125284
3Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва, 119991 4Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук, Москва 119121 Поступила в редакцию 15.12.2014 г. Принята к печати 08.02.2015 г.
Одна из характерных особенностей канцерогенеза — изменение энергетического метаболизма клетки, а именно: активация гликолиза наряду с подавлением окислительного фосфорилирования и, в меньшей степени, цикла Кребса. На основе данных проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA) нами проведен био-информатический поиск генов, связанных с этими процессами и дифференциально экспрессируемых при колоректальном раке (КР). Одним из наиболее перспективных с этой точки зрения оказался ген OGDHL, который кодирует субъединицу оксоглутарат-дегидрогеназного комплекса, участвующего в цикле Кребса и опосредованно отвечающего за индукцию апоптоза. Используя метод количественной ПЦР, мы выявили, в среднем, 8-кратное снижение экспрессии гена OGDHL в 50% (15/30) образцов КР. На основании данных TCGA мы предположили, что основной механизм инактивации гена — гиперметилирование промотора. Методом бисульфитного секвенирования в промоторной области гена OGDHL нами идентифицирован участок (+327...+767 от старта транскрипции), который часто подвергается гиперметилированию в образцах со сниженной экспрессией (80%, 8/10) и, вероятно, вовлечен в механизм инактивации гена. Таким образом, показано, что при КР уровень мРНК гена OGDHL часто и значительно снижен, что, по-видимому, ассоциировано с гиперметилированием идентифицированного участка промоторной области гена. Характер метилирования промотора OGDHL можно рассматривать как потенциальный маркер для дифференциальной диагностики CIMP+ (CpG-island methylator phenotype) опухолей, ассоциированных с плотным гиперметилированием промоторных областей одновременно многих генов.
Ключевые слова: колоректальный рак, OGDHL, количественная ПЦР, бисульфитное секвенирование, снижение экспрессии, гиперметилирование ДНК.
DOWN-REGULATION OF OGDHL EXPRESSION IN COLORECTAL CANCER IS ASSOCIATED WITH PROMOTER HYPERMETHYLATION, by M. S. Fedorova1,#, A. V. Kudryavtseva12,#, V. A. Lakunina1, A. V. Snezhkina1, N. N. Volchenko2, E. N. Slavnova, T. V. Danilova2, A. F. Sadritdinova1,2, N. V. Melnikova , A. A. Belova1, K. M. Klimina3, D. V. Sidorov2, B. Y. Alekseev2, A. D. Kaprin2, A. A. Dmitriev1,2, G. S. Krasnov14* (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia, *e-mail: gskrasnov@mail.ru; 2Herzen Moscow Cancer Research Institute, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow, 125284 Russia; 3\&vilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 4Orekhovich Institute of Biomedical Chemistry, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 119121 Russia). Cell metabolic reprogramming is one of the cancer hallmarks. Glycolysis activation along with suppression of oxidative phosphorylation and TCA cycle occurs in the most of malignant tumors. Bioinformatics search for genes, which are involved in glucose metabolisms and differentially expressed in col-
# Авторы внесли равный вклад.
* Эл. почта: gskrasnov@mail.ru
orectal cancer, was performed using the data of The Cancer Genome Atlas (TCGA) project. OGDHL gene encoding oxoglutarate dehydrogenase complex subunit, which is involved in the TCA cycle and indirectly responsible for the induction of apoptosis, was identified as one the most prospective genes. Using qPCR analysis we revealed on the average 8-fold down-regulation of OGDHL gene in 50% (15/30) of colorectal cancer samples. On the basis of TCGA data we supposed that OGDHL promoter hypermethylation is the major mechanism of the gene inactivation. Using bisulfite sequencing study we identified a region within the gene promoter (+327...+767 downstream TSS), which is frequently methylated in the tumors with down-regulated OGDHL expression (80%, 8/10) and may be crucial for the gene inactivation. Thus, we demonstrated frequent and significant OGDHL down-regulation associated with hypermethylation of the specific region within the gene promoter in colorectal cancer. The pattern of OGDHL gene promoter methylation suggests a possibility of OGDHL to be used for differential diagnosis of CIMP+ (CpG island methylator phenotype) tumors associated with dense hypermethylation of promotor regions of many genes.
Keywords: colorectal cancer, OGDHL, quantitative PCR, bisulfite sequencing, expression down-regulation, DNA hypermethylation.
DOI: 10.7868/S0026898415040047
ВВЕДЕНИЕ
Злокачественная трансформация клетки сопровождается многочисленными генетическими и эпигенетическими изменениями, приводящими к нарушению метаболических процессов и сигнальных путей. Усиление метаболизма глюкозы — одно из ключевых изменений, характерных для большинства онкологических заболеваний. В опухолевых клетках происходит усиленный захват глюкозы и ее последующая переработка наряду с подавлением процессов кислородного, митохон-дриального дыхания. Впервые этот эффект был обнаружен в 1920-х гг. Warburg [1], за что ученый удостоен Нобелевской премии. Многие из генов, отвечающих за энергетический метаболизм, вовлечены в процессы регуляции апоптоза, клеточного цикла и другие процессы, часто подверженные нарушениям при канцерогенезе [2—4]. В настоящее время регуляторные белки и ферменты, участвующие в гликолизе и клеточном дыхании, рассматриваются как одни из возможных мишеней для таргетной противоопухолевой терапии [2, 3].
Значительное изменение экспрессии генов в опухоли — один из признаков их возможного участия в канцерогенезе или, напротив, в супрессии опухоли. На основе данных проекта The Cancer Genome Atlas Project (TCGA), крупнейшего в области молекулярной онкологии, мы провели поиск генов, белки которых вовлечены в процессы энергетического метаболизма, а их экспрессия изменена при колоректальном раке (КР). Это онкологическое заболевание занимает 3-е место в мире по встречаемости и смертности среди мужчин и женщин. Ежегодно по всему миру регистрируют более 1.2 млн. новых случаев КР и более 600 тыс. человек умирает. В течение продолжительного времени заболевание может протекать бессимптомно и поэтому диагностируется уже на поздних стадиях [5].
Биоинформатический анализ данных базы TCGA, сочетающей результаты транскриптомных,
экзомных, метиломных и других крупномасштабных исследований, позволил выбрать для дальнейших исследований ген OGDHL (OGDH-like), расположенный в области 10q11.23. Ген OGDHL кодирует белок, представляющий собой субъединицу комплекса OGDC (2-oxoglutarate dehydrogenase complex) [6]. Белок OGDHL, так же как и его близкий гомолог OGDH, является главной субъединицей оксоглутаратдегидрогеназного комплекса OGDC [7]. Этот митохондриальный мультисубъединич-ный комплекс участвует в цикле Кребса.
В представленной работе методом ПЦР в режиме реального времени показано частое подавление экспрессии гена OGDHL при раке толстой кишки. В результате проведенного биоинформатического анализа базы TCGA выявлено, что гиперметилирование промоторной области гена может вносить значительный вклад в снижение его экспрессии. Методом бисульфитного секвенирования идентифицирован участок промоторной области гена OGDHL, метилирование которого ассоциировано с его инактивацией при КР.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Биоинформатический анализ. Для идентификации возможных изменений в профилях экспрессии и метилирования генов, ассоциированных с метаболизмом глюкозы, нами проанализированы данные базы TCGA для рака ободочной и прямой кишки. Представительность выборок образцов, использованных для анализа, приведена в табл. 1. Отбор генов, ассоциированных с процессами метаболизма глюкозы, выполнен с использованием базы Gene Ontology (http://geneontology. org).
Данные TCGA по оценке метилирования ДНК получены с использованием микрочипов Illumina Infinium 450K BeadChip. С их помощью проанализированы уровни метилирования 450000 CpG-ди-нуклеотидов в геноме человека (в среднем 17 CpG на один ген) — приведена оценка доли ДНК в об-
разце с метилированным CpG в данном положении (в-value). Данные транскриптомного секвени-рования (RNA-Seq) получены на приборах Illumina HiSeq 2000/2500 для фракции полиаденилирован-ных транскриптов.
Для сравнительного анализа паттернов метилирования генов, оценки дифференциальной экспрессии и поиска корреляций разработано приложение CrossHub, реализованное на языке Python. Оценка дифференциальной экспрессии генов выполнена: 1) путем сравнения пула образцов опухоли с пулом образцов нормальной ткани; 2) путем сравнения отношения нормированного числа прочтений в парных образцах. Для анализа дифференциальной экспрессии использован i-тест для независимых (два пула образцов) и зависимых (парные образцы) выборок; общая дисперсия оценена как сумма наблюдаемой дисперсии числа прочтений между разными образцами и дисперсии для распределения Пуассона. Нормирование числа прочтений проводилось по 0.75-му квантилю.
Для каждого из 4226 CpG-островков (представленных на микрочипе и относящихся к генам метаболизма глюкозы) рассчитан скоринг-фактор с учетом величины p-value для U-теста Манна— Уитни, соотношения 0.75-ых квантилей fî-value для пула образцов нормы и опухоли, доли парных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.