ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 2, с. 110-117
КЛЕТОЧНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ^^^^^^^^^^ И ПРОЛИФЕРАЦИЯ
УДК 576:351
ПОПУЛЯЦИЯ НЕЙРОНОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ТИРОЗИНГИДРОКСИЛАЗУ, МИГРИРУЮЩИХ ИЗ ОБОНЯТЕЛЬНЫХ ПЛАКОД В ПЕРЕДНИЙ МОЗГ, В ОНТОГЕНЕЗЕ У КРЫС
© 2004 г. М. С. Извольская*' **, А. Дуиттоз**, И. Тийе**, М. В. Угршмов****
*Институт нормальной физиологии им. П К. Анохина РАМН 103009 Москва, ул. Большая Никитская, д. 6 **Лаборатория контроля овуляции, Национальный институт сельскохозяйственных исследований
37380 Нузийи, Франция ***Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119991 ГСП-1, Москва, ул. Вавилова, д. 26 Поступила в редакцию 20.12.02 г.
Окончательный вариант получен 25.03.03 г.
Обонятельные плакоды, дающие начало обонятельному и респираторному эпителию в онтогенезе, являются источником большого количества нейронов, мигрирующих в передний мозг по направлению роста обонятельных нервов. Одними из самых изученных в этой популяции являются нейроны, экспрессирующие гонадропин-рилизинг гормон. Этот гормон ответствен за центральную регуляцию репродукции у взрослых животных. Ранее было показано, что у плодов человека совместно с гонадотропин-рилизинг гормон-иммунореактивными нейронами в передний мозг мигрирует небольшое количество нейронов, экспрессирующих тирозингидроксилазу - первый фермент синтеза катехоламинов. При помощи одинарного и двойного иммуногистохимического мечения показали существование подобной временной популяции тирозингидроксилаза-иммунореактивных нейронов у плодов крыс. Впервые эти нейроны были обнаружены на веточках обонятельных, терминальных и вомероназальных нервов - вдоль траектории миграции гонадотропин-рилизинг гормон-нейронов на 15-й день эмбрионального развития, что предшествовало появлению гонадотропин-рилизинг гормон-нейронов. На 17-21-е дни обе популяции нейронов обнаружены почти в одних и тех же областях, причем единичные нейроны у плодов на 21-й день развития содержали одновременно и гонадотропин-рилизинг гормон и тирозингидроксилазу. Среди тирозингидроксилаза-иммунореактив-ных нейронов не выявлено нейронов, содержащих декарбоксилазу ароматических аминокислот -второго фермента синтеза катехоламинов, что свидетельствует о некатехоламинергической природе этих нейронов. Однако единичные моноферментные нейроны, содержащие декарбоксилазу, были обнаружены в области передних обонятельных ядер в переднем мозгу, что дает возможность предположить их участие в локальном кооперативном синтезе катехоламинов в области проникновения гонадотропин-рилизинг гормон-нейронов в передний мозг. Таким образом, у крыс в прена-тальном периоде в назальной части головы, вдоль нервов, проецирующихся в передний мозг, и в ростральном отделе переднего мозга обнаружены нейроны, экспрессирующие только тирозингидроксилазу, совместно тирозингидроксилазу и гонадотропин-рилизинг гормон или декарбоксилазу, происхождение и функциональное значение которых обсуждается.
Ключевые слова: эмбриогенез, обонятельный эпителий, гонадропин-рилизинг гормон, передний мозг.
Обонятельные плакоды, формирующиеся как утолщения эпидермы в назальной области головы, дают начало ряду клеточных популяций (На1рет, 1987; БагЬшаи, 1992). Прежде всего, это сенсорные клетки обонятельного эпителия, эпителиальные клетки респираторного эпителия и прочие типы клеток, ответственные за обоняние у взрослых животных. Связь обонятельного эпителия с мозгом формируется в онтогенезе за счет прорастающих к переднему мозгу обонятельных, терминальных и вомероназальных нервов (Бешв-Ы, 1993; УовЫёа е! а1., 1995).
Второй по важности популяцией клеток, происходящей из эпителия обонятельных плакод, является популяция нейронов, экспрессирующих гонадропин-рилизинг гормон (ГРГ). Эти нейроны образуются в эпителии обонятельных плакод на 11-13-й дни эмбрионального развития (Э11-Э13) у мышей ^гау е! а1., 1989), что с учетом срока беременности соответствует Э12-Э14 у крыс. Далее, мигрируя по веточкам обонятельных, вомероназальных и терминальных нервов, ГРГ-нейро-ны проникают через решетчатую пластинку решетчатой кости в передний мозг и затем дости-
гают септо-преоптической области по траектории терминального нерва (рис. 1; Schwanze1-Fuku-ёя, Pfaff, 1989; Wray е! а1., 1989; Daikoku-Ishido е1 а1., 1990; Ronnek1eiv, Resko, 1990; Ca1dani е! а1., 1995). У взрослых млекопитающих ГРГ-нейроны стимулируют выделение лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов клетками аденогипофиза, обеспечивая регуляцию репродукции.
ГРГ-нейроны мигрируют из обонятельных плакод в передний мозг совместно с другими популяциями нейронов, к которым в первую очередь относятся нейроны, содержащие у-амино-масляную кислоту (Tobet et a1., 1996). Кроме того, у куриных эмбрионов в составе терминальных и вомероназальных нервов обнаруживают нейропептид У-иммунореактивные (ЙР) нейроны (ШЫ et a1., 1996). В онтогенезе человека была описана популяция нейронов, мигрирующих совместно с ГРГ-нейронами и экс-прессирующих тирозингидроксилазу (ТГ) (Ver-ney et a1., 1996).
Цель нашей работы - проверить, является ли экспрессия ТГ в популяции нейронов, мигрирующих из эпителия обонятельных плакод по миграционному пути ГРГ-нейронов, видоспецифичной и определить, соэкспрессируют ли ТГ-нейроны де-карбоксилазу ароматических аминокислот (ДАА), являясь таким образом катехоламинерги-ческими.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Животные. Йзучали 12 плодов (по четыре на Э15, Э17 и Э21) от шести беременных крыс линии Вистар. Для получения датированной беременности самцов подсаживали на ночь к самкам. День обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках считали первым днем беременности. Животных содержали в стандартных лабораторных условиях при 12-часовом световом дне и при температуре +20°С.
Фиксация и обработка ткани. Беременным самкам давали наркоз (пентобарбитал, 100 мг/кг веса) и забивали по две на каждый срок беременности. По два плода от каждой самки извлекали из матки и перфузировали через сердце физиологическим раствором на фосфатном буфере (ФРФБ) (0.9% №С1, 0.02 М ФБ, рН 7.4) в течение 5 мин и далее 4%-ным параформальдегидом на 0.1 М ФБ (рН 7.4) в течение 10 мин. После этого производили декапитацию, головы дофиксирова-ли в 4%-ном параформальдегиде на 0.1 М ФБ (рН 7.4) 4-12 ч при температуре +4°С, затем отмывали 30 мин в ФРФБ и помещали на 36 ч в 20%-ный раствор сахарозы на 0.02 М ФРФБ для криопротекции. Головы замораживали в изопента-не, охлажденном до -40°С жидким азотом, и храни-
Рис. 1. Схема миграции ГРГ-нейронов у крыс. ВНН - вомероназальный нерв, ВНО - вомероназаль-ный орган, ДПБ - диагональный пучок Брока, ОН -обонятельный нерв, ОЛ - обонятельный луковицы, ОХ - оптическая хиазма, ПГ - передний гипоталамус, ПК - передняя комиссура, ПО - преоптическая область, ПОЯ - передние ольфакторные ядра, ТН - терминальный нерв.
ли при температуре -80°С. Далее приготавливали сагиттальные серийные срезы толщиной 16 мкм на криостате ("Reichert", Германия) при температуре -20°С. Последовательные срезы монтировали на разные стекла для иммуногистохимичес-кого выявления разных антигенов на соседних срезах.
Одинарное иммуногистохимическое мечение. Для иммуногистохимического выявления ГРГ или ТГ каждую из групп срезов инкубировали во влажной камере последовательно в ФРФБ с: 1) 1%-ной нормальной сывороткой козы и 0.3%-ным Тритоном X-100 ("Sigma", США) 30 мин при комнатной температуре; 2) первичными антителами кролика против синтетического ГРГ (1 : 15000) или ТГ (1:3000), 1%-ной нормальной сывороткой козы и 0.3%-ным Тритоном X-100 15 ч при +4°С; 3) вторичными биотинилированными антителами козы против иммуноглобулинов кролика (1 : 200) ("Vector Laboratories, BIOSYS", США) 2 ч при комнатной температуре и 4) ави-дин-пероксидазным комплексом ("Vector Laboratories, BlOSYS", США) 1 ч при комнатной температуре. Срезы промывали в ФРФБ после каждой инкубации за исключением первой. На последнем этапе срезы промывали в 0.05 М трис-буфере (pH 7.6), пероксидазную реакцию выявляли в том же буфере, содержащим 0.03% 3,3'-диаминобензи-дина тетрагидрохлорида ("Sigma", США) и 0.01% Н202 под контролем бинокулярной лупы. Затем срезы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в пермаунт.
Двойное иммуногистохимическое мечение. Для одновременного выявления двух (ГРГ/ТГ или ТГ/ДАА) антигенов использовали двойное имму-
Рис. 2. ТГ-ИР-нейроны в носовой перегородке у плодов крыс на Э15.
а, б - двойное иммунофлуоресцентное мечение; ТГ-ИР (а, стрелка), но ДАА-иммунонегативный (б, стрелка) нейрон; в - одинарное иммуногистохимическое мечение на ТГ; ТГ-ИР-нейроны (стрелки) около терминальных и вомерона-зальных нервов (ТН/ВНН). Масштаб: а, б - 10, в - 20 мкм.
щ
4 4
ТН/ВНН ТН/ВНН
•
/ ТН/ВНН
"N. '- -
ТН/ВНН ^ HR
- ж
* *
ТН/ВНН
, 1 1
нофлуоресцентное мечение. Перед обычной обработкой срезы подвергали нагреванию в микроволновой печи для обеспечения максимального доступа антител к антигенам. Для этого срезы инкубировали в обычной микроволновой печи ("Samsung Electronics", Южная Корея) при интенсивности излучения 700 Вт три раза по 3 мин в 0.01 М цитратном буфере (рН 6.0). Как было показано ранее, подобная обработка заметно увеличивает интенсивность окрашивания иммуноги-стохимической реакции, что особенно важно для выявления структур с низкой антигенной активностью при сочетании моноклональных антител и флуоресцентных маркеров (Werner et al., 1996; Shi et al., 2001). После этого срезам давали остыть в том же буфере 20 мин, ополаскивали в ФРФБ и затем инкубировали в том же буфере последовательно с: 1) нормальной сывороткой овцы (1 : 15) и 0.3%-ным Тритоном X-100 30 мин при комнатной температуре, 2) смесью моноклональных антител против Тг (1 : 100) ("Boehringer Mannheim GmbH", Германия) с антителами кролика против синтетического ГРГ (1 : 3000) или с антителами кролика против ДАА (1 : 500), 1% бычьего сывороточного альбумина и 0.3%-ным Тритоном X-100 в
течение ночи при +4°С, 3) смесью вторичных антител козы против иммуноглобулинов мыши, меченных родамином (1 : 200) ("Jackson Immunore-search", США), с вт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.