БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 87 - 95
УДК 577.112;577.122
ПОПЫТКА ОПТИМИЗИРОВАТЬ СВОЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ХИМЕР МАЛОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА HspB1 ПУТЕМ ИЗМЕНЕНИЯ ДЛИНЫ И ПРИРОДЫ ЛИНКЕРА*
© 2015 П.Н. Дацкевич, Л.К. Муранова, Н.Б. Гусев**
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)939-2747, электронная почта: NBGusev@mail.ru
Поступила в редакцию 02.10.14 После доработки 14.10.14
Получены и охарактеризованы химерные белки, состоящие из желтого флуоресцентного белка (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP), соединенного линкерами различной длины и природы с N-концом малого белка теплового шока человека HspB1. В качестве линкеров, соединяющих два белка, были использованы 12-членные высокоподвижный глицин-сериновый линкер (L1), жесткий а-спиральный линкер (L2) и жесткий аланин-пролиновый линкер (L3). Помимо этого были получены химеры с высокоподвижным гли-цин-сериновым линкером длиной 12, 18 и 21 а.о. В отличие от белка дикого типа, образующего стабильные крупные олигомеры, содержащие в своем составе более 20 субъединиц, все флуоресцентные химеры вне зависимости от длины или природы линкера образуют только сравнительно мелкие (5—9 субъединиц) малостабильные олигомеры, склонные к диссоциации при низкой концентрации белка. При использовании ли-зоцима в качестве модельного субстрата шапероноподобная активность всех флуоресцентных химер была больше аналогичной активности белка дикого типа, при этом активность химер с линкерами типа L1 и L3 в меньшей степени отличалась от соответствующей активности белка дикого типа по сравнению с химерой, содержащей жесткий а-спиральный линкер типа L2. По мере увеличения длины линкера L1 от 12 до 21 а.о. происходило уменьшение различий в шапероноподобной активности флуоресцентных химер и белка дикого типа. Поэтому для получения флуоресцентных химер с шапероноподобной активностью, сопоставимой с аналогичной активностью белка дикого типа, желательно использовать достаточно длинные высокоподвижные линкеры. В связи с тем, что N-концевой домен малых белков теплового шока участвует в формировании олигомеров, любые способы прикрепления флуоресцентного белка к N-концу HspB1 приводят к драматическим изменениям его олигомерного состояния.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: малые белки теплового шока, HspB1, флуоресцентные химерные белки, четвертичная структура, шапероноподобная активность.
Малые белки теплового шока ^Шр или НрВ) относятся к широко распространенному семейству белков, представители которого участвуют в поддержании белкового гомеостаза, а также в регуляции ключевых процессов жизнедеятельности клетки [1]. 8№р влияют на синтез [2] и деградацию белков [3], регулируют процессы апоптоза [4] и пролиферации [5], динамику цитоскелета [5—7] и др. В связи с тем, что 8Нзр участвуют в регуляции многочисленных процессов, нарушение уровня экспрессии или мутации в генах, кодирующих 8Нзр, коррелиру-
Принятые сокращения: sHsp — малые белки теплового шока, а.о. — аминокислотные остатки.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-244, 28.12.2014.
** Адресат для корреспонденции.
ет с развитием онкологических и нейродегене-ративных заболеваний, различных видов катаракты и миопатий [8].
Характерной чертой всех 8№р является наличие консервативного а-кристаллинового домена, имеющего структуру двойного в-складчатого листа [9]. Этот домен фланкирован менее консервативными и менее упорядоченными N и С-концевыми доменами, регулирующими олигомерное состояние и функциональную активность 8№р [10, 11]. В геноме человека обнаружено десять генов, кодирующих десять белков семейства 8№р, различающихся по свойствам и тканевому распределению [12], среди которых НрВ1 и №рВ5 наиболее подробно изучены и обладают самым широким спектром действия.
В связи с тем, что 8№р участвуют в многочисленных процессах и поэтому могут быть связаны с возникновением различных заболеваний
человека, в настоящее время наблюдается повышенный интерес к этой группе белков [13, 14]. Для детального понимания механизма функционирования 8Ир необходимо подробное исследование их структуры и свойств. Флуоресцентные химеры, получаемые путем слияния разноцветных флуоресцентных белков и 8№р, открывают широкие возможности для исследований, проводимых в живой клетке, и могут использоваться для изучения внутриклеточной локализации и белок-белковых взаимодействий. Химерные белки, состоящие из 8№р человека и производных зеленого флуоресцентного белка, довольно давно применяются для изучения свойств [15—19]. Большинство указанных исследований проводилось на клеточном уровне без анализа физико-химических свойств полученных химер. При этом стоит заметить, что молекулярная масса флуоресцентных белков сопоставима с молекулярной массой 8№р или даже превышает ее. Кроме того, прикрепление флуоресцентных белков как к так и к С-кон-цу 8№р, играющих важную роль в функционировании и олигомеризации 8№р [11, 20], может сопровождаться значительным изменением их свойств.
Исследования, проведенные в нашей лаборатории [21—23], показали, что ранее описанные флуоресцентные химеры существенно отличаются от белков дикого типа по размеру формируемых ими олигомеров, шаперонопо-добной активности и способности образовывать гетероолигомерные комплексы с другими 8№р. Наибольшие различия в свойствах флуоресцентных химер и белков дикого типа были выявлены в случае двух 8Нзр, №рВ1 и №рВ5, склонных образовывать крупные олигомеры. Все это делает затруднительным использование описанных ранее флуоресцентных химер для анализа структуры и свойств 8№р. В то же время, как уже отмечалось, использование флуоресцентных химер открывает широкие возможности для исследования разных белков, и это делает очень желательным получение флуоресцентных химер 8№р со свойствами, мало отличающимися от свойств белков дикого типа. Хорошо известно, что свойства флуоресцентных химер зависят от длины и природы последовательностей (линкеров), соединяющих два белка в составе химерной конструкции [24, 25]. Для того чтобы получить химеру, свойства которой в наименьшей степени отличались бы от свойств белка дикого типа, мы попытались в данной работе создать флуоресцентные химеры, несущие флуоресцентный белок на ^-конце №рВ1 и соединенные с ним линкерами разной длины и разной структуры.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение молекулярно-генетических конструкций. Для получения кДНК химер с 12-членными линкерами методом ПЦР амплифицировали фрагменты кДНК, кодирующие HspBl человека и желтый флуоресцентный белок (EYFP). При этом используемые праймеры содержали участки будущей линкерной последовательности и участок узнавания определенной рестриктазы. Фрагменты обрабатывали рестриктазами и ли-гировали, после чего клонировали в вектор pET23b(+) по участкам NdeI и XhoI. Последовательности линкеров, использованные рестрик-тазы и праймеры представлены в табл. 1.
кДНК химер с линкером типа L1 (подвижный неупорядоченный линкер) различной длины получали методом Overlap Extension PCR. Для этого использовали праймеры, содержащие перекрывающиеся участки будущего линкера. С помощью таких праймеров амплифицировали кДНК HspBl и EYFP, содержащие перекрывающиеся фрагменты линкерной последовательности. Затем, используя кДНК частей химеры и «внешние» праймеры, методом ПЦР получали полноразмерую кДНК химерного белка. Полноразмерную вставку клонировали в вектор pET23b(+) по участкам Ndel и XhoI. Последовательности линкеров и использованные прайме-ры представлены в табл. 2.
Все полученные конструкции проверяли секвенированием.
Экспрессия и выделение химерных белков. Условия экспрессии и выделения химерных белков подбирали, основываясь на разработанной ранее методике [21]. Клетки E. coli штамма BL21 (DE3) трансформировали полученными плаз-мидами. Для приготовления ночной культуры одну колонию с чашки Петри инокулировали в 40 мл среды Луриа—Бертани (LB), содержавшей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивали при 37°. Ночную культуру переносили в 800 мл трехкратной среды LB, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина (по 400 мл в двух колбах емкостью 2 л), инкубировали 7 ч при 37°, затем 16 ч при 30°. Клетки осаждали центрифугированием (10 мин, 5000 g) и суспендировали в 40 мл лизис-буфера (50 мМ Tris-На, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 14 мМ ß-меркаптоэтанол). Суспензию замораживали до последующего выделения белков.
В ходе выделения белков клетки бактерий обрабатывали лизоцимом (конечная концентрация 0,05 мг/мл, 30 мин), ДНКазой I (конечная концентрация 2,5 мкг/мл, 30 мин, в присутствии 1,75 мМ MgCl2) и проводили двукратную обработку ультразвуком на дезинтеграторе Branson S250D (США)
(4 раза по 40 с, 40% мощности). Осадок отделяли центрифугированием, полученный супернатант фракционировали сульфатом аммония в интервале насыщения 0—40%. Осадок после центрифугирования (20 мин, 23 700 g) суспендировали в буфере Б (20 мМ Tris-Ac, рН 7,6, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 14 мМ р-меркаптоэтанол, 0,1 мМ PMSF), диализовали в течение ночи против 2 л буфера Б, центрифугировали (30 мин, 105 000 g) и наносили на анионообменную колонку HiTrapQ 5 мл («Amersham Pharmacia Biotech», Великобритания). После промывки колонки химерные белки элюи-ровали линейным градиентом NaCl (10—500 мМ).
Дальнейшую очистку полученных образцов проводили методом гель-фильтрации на колонке Superdex 200 HiLoad 26/60 («Amersham Pharmacia Biotech», Великобритания), уравновешенной буфером Б, содержавшим 150 мМ NaCl. Фракции, обогащенные целевым белком, объединяли, концентрировали с помощью ультрафильтрации и ди-ализовали в течение ночи против 2 л буфера Б, содержавшего 2 мМ дитиотреитол (ДТТ) вместо Р-меркаптоэтанола. Полученный образец разделяли на аликвоты и замораживали.
Исследование олигомерного состояния химерных белков. Четвертичную структуру флуоресцент-
Таблица 1. Праймеры, использованные для получения химер НрВ1 с разными типами линкера
EYFP-L1-HspB1: линкер Ll: GSAGSAATGGSA, рестриктаза AgeI
HspB1_L1_fw FP Ll rev
5'-TTA
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.