БИОЛОГИЯМОРЯ, 2013, том 39, № 1, с. 44-49
УДК 579.841.1:577.112.314 БИОХИМИЯ
ПОРИНЫ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOALTEROMONAS (GAMMAPROTEOBACTERIA: PSEUDOALTEROMONADACEAE)1
© 2013 г. О. Д. Новикова1, В. А. Хоменко1, Г. М. Фролова1, Г. Н. Лихацкая1, Л. А. Романенко1, О. Ю. Портнягина1, С. М. Кузнецова2, Т. Ф. Соловьева1
'Тихоокеанский институт биоорганической химииДВО РАН, Владивосток 690022;
2Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 142292 e-mail: novolga_05@mail.ru; svemikuz@rambler.ru
Статья принята к печати 29.03.2012 г.
Из морских бактерий рода Pseudoalteromonas (P. haloplanktis, P. tetraodonis,Pseudoalteromonas sp. КММ 223) выделены фракции наружной мембраны (НМ), чистота которых подтверждена методом ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия и техники бислойных липидных мембран (БЛМ) показано, что в состав НМ морских псевдомонад входят термозависимые пориноподобные белки. Из морской бактерии P. haloplanktis выделены порообразующие белки П-1 и П-2 с молекулярной массой 43 и 39 кДа соответственно. Характер флуктуаций тока в БЛМ и величина проводимости пор, образованных данными белками, свидетельствуют о том, что выделенные порины не идентичны по своим функциональным свойствам. Для белка П-2 обнаружен нелинейный характер зависимости величины проводимости канала от концентрации соли в водной фазе, что характерно для поринов морских бактерий.
Ключевые слова: морские бактерии, наружная мембрана, порины, бислойные липидные мембраны.
Porins from marine bacteria of the genus Pseudoalteromonas (Gammaproteobacteria: Pseudoalteromonada-ceae). O. D. Novikova1, V. A. Khomenko1, G. M. Frolova1, G. N. Likhatskaya1, L. A. Romanenko1, O. Yu. Portnyagina1, S. M. Kuznetsova2, T. F. Solovyeva1 ('Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690022; institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences, Pushchino 142292)
Outer membrane (OM) fractions were isolated from marine bacteria of the genus Pseudoalteromonas (P. haloplanktis, P. tetraodonis, and Pseudoalteromonas sp. KMM 223). The purity of OM fractions was confirmed by ultracentrifuga-tion in a sucrose gradient. Using the SDS-PAG electrophoresis and the bilayer lipid membrane (BLM) technique, heat-modifiable porin-like proteins were identified among the OM proteins of marine pseudomonads. Pore-forming proteins P-l and P-2 with a molecular mass of 43 and 39 kDa, respectively, were obtained from the marine bacterium Л haloplanktis. The nature of current fluctuations in the BLM and the conductivity of pores formed by these proteins suggest that the isolated porins are not identical in their functional properties. A nonlinear dependence of channel conductivity on salt concentration in aqueous phase was found for the P-2 protein, which is typical of marine bacterial porins. (Biologiya Morya, 2013, vol. 39, no. 1, pp. 44-49).
Keywords: marine bacteria, outer membrane, porins, bilayer lipid membrane.
Как известно, морские бактерии являются основными участниками процессов минерализации органических веществ, круговорота питательных элементов и переноса энергии в океанической среде (Канава, 2004). В экосистемах эти процессы лимитированы, главным образом, количественными и качественными характеристиками источников питания микроорганизмов. Различные факторы окружающей среды, например, такие, как осмомолярность, температура и дефицит фосфата, влияют на синтез (экспрессию) белков наружной мембраны (НМ) бактерий, в частности поринов, осуществляющих в клетке транспортную функцию. Показано (Ваг11ей й а1., 1993; Чъъта й а1., 2005), что при изменениях в геноме морских бактерий изменения происходят, в том числе,
в генах, кодирующих мембранные белки. В этой связи структура и свойства порообразующих белков могут иметь определяющее значение для адаптации микроорганизмов к условиям окружающей среды.
Экстремальные условия обитания морских микроорганизмов служат причиной некоторых изменений в структурной организации их клеточной стенки. В отличие от наземных, морские бактерии имеют нетипичную локализацию жесткого пептидогликанового слоя (ПГ). Так, у морских псевдомонад он прочно связан с внешней стороной цитоплазматической мембраны и поэтому не обнаруживается на электронных микрофотографиях тонких срезов клетки (ТогеЬещ й а1., 1970а, Ь). Установлено также, что сборка и стабилизация структуры клеточной
1 Работа поддержана грантом РФФИ-ДВО РАН № 11-04-98584 "Изменение структуры и функции компонентов наружной мембраны морских
психрофильных бактерий как способ адаптации к экстремальным условиям обитания".
стенки морских бактерий осуществляются с помощью мостиков, образованных ионами магния между анионными группами белков и фосфолипидов (De Voe, Oginski, 1969а, b). Вследствие этого НМ легко отделяется при последовательной экстракции клеточной массы растворами высокой ионной силы даже без предварительного разрушения клеток (Diedrich, Cota-Robles, 1974; Nelson, Macleod, 1977).
К настоящему времени достигнуты значительные успехи в изучении структуры и функции поринов наземных грамотрицательных бактерий, в основном представителей семейства Enterobacteriaceae (Benz, 1988; Nikaido, 2003); подобные белки морских бактерий исследованы в меньшей степени. Так, описаны выделение и дана характеристика порообразующих белков из бактерий рода 'Vibrio (Koga, Takumi., 1994; Chakrabarti et al., 1996; Simón et al., 1998; Duret et al., 2010). Из морских бактерий рода Photobacterium выделены порины с необычными свойствами, которые авторы объясняют тем, что эти бактерии являются глубоководными (Bartlett et al., 1993). В последние годы наметился прогресс в изучении молекулярных механизмов экспрессии белков НМ у глубоководных бактерий родов Photobacterium и Shewanella (Welch, Bartlett, 1998; Vezzi et al., 2005; Xiao et al., 2008). Описаны примеры изучения порообразующих свойств OmpH и OmpL поринов из глубоководной морской бактерии Photobacterium profundum с помощью пэтч-клямп (patch-clamp) экспериментов (Macdonald et al., 2003) и белка НМ Vibrio harveyi с использованием техники бислойных липидных мембран (БЛМ) (Schulte et al., 2009). Тем не менее, одним из наиболее важных остается вопрос, насколько методы, разработанные для выделения и характеристики функциональных свойств поринов наземных микроорганизмов, могут быть использованы при изучении поринов морских бактерий.
Несмотря на то, что для целого ряда порообразующих белков известны детали атомной структуры, полного понимания механизмов неспецифического транспорта через НМ бактерий до сих пор нет. Необычные условия функционирования пориноподобных белков морских бактерий делают их интересным объектом для исследования. Детальное изучение этих белков позволит определить специфические особенности их структуры и проявления порообразующих свойств, которые связаны с условиями обитания морских бактерий.
В данной работе исследованы порины грамотрицательных морских бактерий, в частности, разработаны методы выделения индивидуальных порообразующих белков и дана характеристика их функциональной активности. Объектами исследования являлись порины бактерий рода Pseudoalteromonas, выделенные из НМ двух типовых штаммов - Р. haloplanktis и Р. tetraodonis, а также дикого штамма Pseudoalteromonas sp. КММ 223.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Микроорганизмы. Морские бактерии рода Pseudoaltero-monas (Р. haloplanktis АТСС 14393ти Р. tetraodonislAM 14160х) выделены из открытых океанических вод или морских осад-
ков. Штаммы морских бактерий выращивали при комнатной температуре в среде, содержащей морскую воду, как описано ранее (Svetashev et al. 1995).
Выделение НМ морских бактерий. Бактериальные клетки Р. haloplanktis, Р. tetraodonis и Pseudoalteromonas sp. КММ 223 отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 16000 g в течение 15 мин при температуре 4°С и 3 раза промывали свежеприготовленным охлажденным солевым раствором, содержащим 0.22 М NaCl, 0.026 М MgCl2H 0.01 М КС1 (1/3 от объема среды роста). Для отделения поверхностных структур, слабо связанных с НМ, клетки 3 раза обрабатывали 0.5 М раствором NaCl (1/6 от объема среды роста) с последующим центрифугированием при 16000 g, 15 мин, 4°С. После удаления поверхностного слоя клетки суспендировали в 0.5 М растворе сахарозы (1/6 от объема среды роста) и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Суспензию центрифугировали при 35000 g, 20 мин, 4°С. Обработку повторяли 3 раза. Объединенные супернатанты центрифугировали при 73000 g, 2 ч, 4°С. Полученный осадок, представляющий собой фракцию НМ исследуемых бактерий, диспергировали в дистиллированной воде и хранили при температуре -20°С. Для экспериментов по определению функциональной активности полученных белковых фракций их суспендировали в 0.25% растворе додецилсульфата натрия (SDS).
Выделение и очистка белков ДМФракцию пориноподобных белков из НМ Р. haloplanktis получали по методу Нюрминен (Nurminen, 1978). Метод включает разрушение ПГ-слоя лизоцимом, обработку клеточных оболочек трипсином в присутствии неионного детергента Тритон Х-100 и экстракцию 0.5 М раствором NaCl в течение ночи при 42°С. Последующую очистку от сопутствующих белков проводили с помощью гель-хроматографии на колонке (65 х 2 см) с сефакрилом S-300 в Трис-HCl буфере (30 мМ, рН 7.8) (буфер А), содержащем 10 мМ EDTA и 0.25% SDS, и последующей ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефарозой CL 4В (40 х 2 см), уравновешенной буфером А, содержащим 0.12% детергента Бридж 35 (Brij 35). Элюирование белков с носителя осуществляли с использованием градиента NaCl от 0 до 2 М в буфере А, содержащем 0.12% детергента Бридж 35. Для экспериментов по определению функциональной активности полученных белков Бридж 35 удаляли из образцов белка с помощью гель-хроматографии на колонке с G-25 (30 х 1.3 см), предварительно уравновешенной Трис-HCl буфером (10 мМ, рН 7.8), содержащим 0.25% SDS.
Анализ белко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.