МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 2, с. 343-351
ДРУГИЕ ПРОБЛЕМЫ
УДК 578.2213.2
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, НЕОБХОДИМАЯ ДЛЯ ИНИЦИАЦИИ СИНТЕЗА РНК, В Э'-НЕКОДИРУЮЩЕЙ ОБЛАСТИ ГЕНОМА ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
© 2004 г. Ming Xiao12, Jun Chen2, Yujing Wang2,Yamei Zhen2,Wenwei Lu2,
Jiakuan Chen1, Bo Li1*
1Ministry of Education Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering, The Institute of Biodiversity
Science, Fudan University, Shanghai, 200433, China 2College of Life and Environment Sciences, Shanghai Teachers' University, Shanghai, 200234, China
Поступила в редакцию 28.04.2003 г.
Вирус классической чумы свиней (CSFV) вызывает болезнь, важную в экономическом отношении. Ранее с помощью метода оценки количества информации мы предсказали, что 21-нуклеотидная последовательность, локализованная на нетранслируемом З'-конце (3'UTR), важна для репликации генома CSFV. В данной работе мы экспериментально изучили эту последовательность с помощью сайт-направленного мутагенеза. Показано, что полноразмерные 3'UTRs способны инициировать синтез РНК, а 3'UTRs, лишенные последних 21 н. - нет. Концевая 21-нуклеотидная последовательность в отсутствие остальной части 3'UTR способна инициировать синтез РНК, хотя и со значительно меньшей эффективностью. Показано, что эта последовательность нужна для репликации генома CSFV. Остальная часть 3'UTR также необходима для нормального синтеза РНК. Весьма вероятно, что 21-нуклеотидная последовательность участвует в инициации репликации генома CSFV, а в остальной части 3'UTR локализованы элементы, обеспечивающие нормальный уровень синтеза РНК. Высказано предположение, что репликаза CSFV связывается с этой последовательностью и инициирует репликацию генома CSFV. Показано, что мутация в позиции 216 21-нуклеотидной последовательности и замены 3'-концевого нуклеотида 3'UTR приводят к прекращению инициации синтеза РНК, а мутация в положении 212 не влияет на инициацию, но приводит к снижению уровня синтеза РНК. Из четырех мутаций 3'UTR в положении 219 три приводят к прекращению инициации синтеза РНК, а одна вызывает снижение уровня синтеза РНК. Таким образом, для синтеза РНК наиболее важен тимин в позиции 216, а кроме того, важны гуанин в положении 219 и цитидин в положении 228; тимин в позиции 212 имеет наименьшее значение.
Ключевые слова: вирус классической чумы свиней (CSFV), сайт-направленный мутагенез, 3'UTR, синтез РНК, сайт узнавания.
Вирус классической чумы свиней (CSFV), вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV) и вирус болезни Бордера (BDV) относятся к роду Pes-tivirus семейства Flaviviridae. Это семейство включает три рода: Flavivirus, Pestivirus и Hepacivirus. Их геномы организованы сходным образом [1-8]. Геном CSFV (около 12.5 т.п.н.) представлен одно-нитевой (+)РНК, содержащей одну большую открытую рамку считывания, а также 5'-концевую нетранслируемую область (5'UTR) и 3'-концевую нетранслируемую облась (3'UTR). При трансляции этой рамки образуется полипептид, из которого в ходе процессинга вирусные и клеточные протеазы образуют 12 зрелых белков. Из них 5 являются структурными белками (Npro, C, E1, E2, E0) и 7 - неструктурными (P70, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). Белок NS5B отвечает за репликацию генома CSFV. Болезнь, вызываемая ви-
*Эл. почта: xiaoming88@263.net; xiaom@shtu.edu.cn
русом CSFV, - одна из важных с точки зрения экономических последствий [9], однако патогенез чумы свиней все еще не вполне ясен. Изучение механизма репликации генома, в частности этапа инициации репликации CSFV, может служить одной из отправных точек для исследования пато-генности CSFV.
Репликацию генома РвзтЫтиз осуществляет РНК-зависимая РНК-полимераза - репликаза (ЯёЯр). Все ЯёЯр вирусов, имеющих (+)РНК-ге-ном, имеют сходную структуру и содержат домены, обозначаемые А, В, С, Б и Е [10-12]. Ген ^5В CSFV расположен в 3'-концевой области генома, рядом с З'-ИТЯ; таким же образом этот ген организован в геномах BVDV и вируса гепатита С (HCV). В опытах по экспрессии ^5В показано, что этот белок имеет активность ЯЖр у HCV [2, 5], BVDV [6] и CSFV [13-15].
З'ИТЯ, по-видимому, участвует в инициации репликации генома Рвзйу1тш, репликация кото-
poro состоит из двух последовательных этапов. Сначала репликаза связывается с 3'-UTR и начинает репликацию генома, в ходе которой на матрице (+)РНК образуется (-)РНК. Затем на матрице (-)РНК образуется (+)РНК [16-19, 7-9, 20]. Исследованию механизма репликации вирусов с (+)РНК геномом посвящено всего несколько работ, поэтому о нуклеотидной последовательности и структуре сайтов связывания репликазы известно мало. В ходе предыдущих исследований [21, 22] мы получили некоторые данные о последовательностях и структурах сайтов инициации репликации CSFV, однако прямых экспериментальных подтверждений на молекулярном уровне мы не имели. В ходе данной работы мы экспрес-сировали белок NS5B CSFV, обладающий активностью RdRp, и с помощью сайт-направленного мутагенеза получили ряд мутантов с заменами в области 3'UTRs. Далее мы провели синтез и анализ РНК в присутствии белка NS5B и различных 3'UTRs. Главной целью этой работы было найти последовательности в 3'UTR, необходимые для инициации синтеза геномной РНК CSFV.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Плазмидные конструкции. Все плазмидные конструкции получены с помощью стандартных методов [23]. Последовательность, содержащая ген NS5B CSFV, получена из геномной РНК штамма CSFV Shimen с помощью обратной транс-криптазы и ПЦР (ОТ-ПЦР) и клонирована в векторе pGEM-T ("Promega"). Полноразмерную кДНК гена NS5B получали из вектора pGEM-T с помощью ПЦР и клонировали в векторе pcDNA-3.1 ("Clontech"). После лигирования и трансформации полученная плазмида NS5B/pcDNA-3.1 содержала полную последовательность гена NS5B и была использована для трансфекции клеток PK-15.
Культуры клеток. Клетки PK-15 получены из коллекции China Center for Type Culture и использованы для экспрессии белка NS5B. Клетки выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) ("Gibco BRL", Германия) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Клетки инкубировали при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO2.
Трансфекция. Рекомбинантную плазмиду NS5B/pcDNA-3.1 выделяли с помощью набора Wizard plus Minipreps DNA purification system ("Prome-ga"). Трансфекцию клеток PK-15 плазмидой NS5B/pcDNA-3.1 проводили в 16-луночных планшетах с помощью реактива LipofectAMINE™2000 (LF2000) в соответствии с рекомендациями производителя ("Gibco BRL"). В каждую ячейку с 0.5 мл клеток PK-15 (3 х 105 шт.) добавляли 1 мкг плаз-миды NS5B/pcDNA-3.1, растворенной в 50 мкл среды DMEM без сыворотки, и смешивали с 50 мкл
среды DMEM без сыворотки, содержащей 3 мкл LF2000. После инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин комплексы ДHK-LF2000 добавляли непосредственно в лунки с культурой клеток. 16-луночные планшеты с этими комплексами инкубировали при 37°C в атмосфере CO2 в течение 36 ч и затем анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.
Получение цитоплазматических экстрактов из клеток PK-15. Через 36 ч после трансфекции клетки осаждали, трижды промывали PBS, осторожно растворяли в лизирующем буфере (200 мМ Трис-HCl, pH 8.0), 500 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 2% Тритон X-100, 10мМ имидазол, 50% глицерин) и инкубировали 30 мин при 4°C. После центрифугирования в течение 10 мин при 10000 g и температуре 4°C отбирали супернатант.
Аутентичность экспрессированного белка NS5B устанавливали, как описано ранее [23]. Наличие белка NS5B определяли с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и последующего окрашивания кумасси. Вестерн-блот гибридизацию проводили как описано ранее [23]. Поликлональные антитела кролика к NS5B CSFV получали с помощью стандартной методики [23].
Транскрипция in vitro. 3'UTRs получали с помощью транскрипции in vitro. Молекулы кДНК, содержащие полноразмерную последовательность 3'UTR (228 п.н.) и прилегающую кодирующую последовательность (375 п.н.) штамма Shimen CSFV, клонировали в векторе pGEM-T ("Promega"). С помощью ПЦР на основе плазмид pGEM-T, содержащих полноразмерные поледовательности 3'UTR, получали матрицы для транскрипции in vitro. Использовали следующие праймеры: 5' TAATAC-GACTCACTATAAGCTGGCCAAG 3' (содержит промотор РНК-полимеразы фага Т7) и 5' GGGC-CGTTAGGAAATTACCTTAGTC 3'. Продукты амплификации служили матрицей для транскрипции in vitro и, помимо 3'UTR и 3'-конца кодирующей последовательности, содержали промотор для Т7 РНК-полимеразы. Транскрипцию in vitro проводили в 50 мкл реакционной смеси в соответствии со стандартной методикой: 20 мкл 5-кратного буфера для транскрипции, 2 мкл РНКазина (20-40 ед/мкл) ("Promega"), 5 мкл каждого NTP (2.5 мМ), 5 мкг матрицы, 2 мкл T7 РНК-полимеразы (10-20 ед/мкл) ("Promega"). Смесь инкубировали при 37°C в течение 2 ч, добавляли 10 мкл ДНКазы ("Takara") и инкубировали 15 мин при 37°C. Далее пробу экстрагировали смесью фе-нол/хлороформ/изопропанол, РНК осаждали этанолом, высушивали и растворяли в 20 мкл деио-низованной H2O. Синтезированная РНК содержала полноразмерный 3'UTR, а также прилежащий 3'-концевой участок кодирующей последователь-
последовательность, необходимая для инициации синтеза рнк 345 Таблица 1. Праймеры, использованные в работе
TAATACGACTCACTATAAGCTGGCCAAG
1 5'- GGGCCGTTAGGAAATTACCTTAGTC-3'
2 5'- GGGCCGTTAGGAAATTTCCTT-3'
3 5'- GGGCCGTTAGGAAATTCCCTT-3'
4 5'- GGGCCGTTAGGAAATTGCCTT-3'
5 5'- GGGC CGTT AGGAAAT TCCTTAGTCCAACTGT GGACG-3'
6 5'- GGGCCGTTAGGATATTACCTT-3'
7 5'- GGGCCGTTAGGACATTACCTT-3'
8 5'- GGGCCGTTAGGAGATTACCTT-3'
9 5'- GGGCCGTTAGGAATTACCTTAGTCCAACT-3'
10 5'- GGGC CGTTAT GAAAT TACCTT-3'
11 5'- GGGC CGTT AAGAAAT TACCTT-3'
12 5'- GGGC CGTTAC GAAAT TACCTT-3'
13 5'- GGGC CGTT AGAAAT TACCTTAGTC-3'
14 5'- TGGCCGTTAGGAAATTACCTT-3'
15 5'- C GGC CGTT AGGAAAT TACCTT-3'
16 5'- AGGCCGTTAGGAAATTACCTT-3'
17 5'- GGCCGTTAGGAAATTACCTT-3'
18 5'- AGTCCAACTGTGGACGTCAGGAATT-3'
19 5'- GGGCCGTTAGGAAATTACCTTCATACCCCTCTCCCTATCAGGGTCATCATC-3'
20 5'- GGGCCGTTAGGAAATTACCTTTCATACCCCTCTCCCTATCAG
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.