ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2011, том 437, № 5, с. 703-708
^ ОБЩАЯ
БИОЛОГИЯ
УДК 597.211+575.17
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА СУБЪЕДИНИЦЫ I
ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ (COI) мтДНК МИНОГ, ОТНОСИМЫХ К LETHENTERON CAMTSCHATICUM И LETHENTERON REISSNERI COMPLEX, НЕ ИМЕЮТ РАЗЛИЧИЙ ВИДОВОГО УРОВНЯ © 2011 г. В. С. Артамонова, А. В. Кучерявый, академик Д. С. Павлов
Поступило 20.12.2010 г.
Исторически в систематике миног важную роль отводили жизненной стратегии. На этом основании в ряде случаев были выделены так называемые сателлитные группы видов [1]. Личинки миног внутри сателлитной группы неразличимы морфологически, но взрослые миноги различаются по ряду признаков (прежде всего, по длине тела). Считается, что после метаморфоза миноги одного вида мигрируют в крупные водоемы (реки, озера, моря, океаны), становятся паразитами костистых рыб и приступают к размножению спустя 0.5—3 года, а особи другого вида не покидают родную реку, становятся половозрелыми спустя 6—10 мес и затем погибают [1—4]. В сателлитную группу входит, как правило, один паразитический анадромный вид и его виды-спутники — непаразитические или паразитические резидентные виды, которые, как полагают, произошли от первого симпатрически [1, 4].
В частности, принято считать, что на Дальнем Востоке обитают паразитическая проходная минога Ь. сат18сИаИсит и симпатрически произошедший от нее вид Ь. ге^пей. Изначально считали, что этот вид связан общностью происхождения с Ь. ]арошсит, однако позже было признано, что вид Ь. ]арошсит синонимичен виду Ь. сат18сИаИ-сит, который исторически был описан раньше [5]. Кроме того, по данным некоторых авторов на Дальнем Востоке встречается сибирская непаразитическая минога Ь. ке881ей [6], которую относят в настоящее время к той же группе, что Ь. сат18сИа1-кит и Ь. ге^пей.
В последние годы японские исследователи уделяли большое внимание изучению генетических особенностей жилых непаразитических миног Дальнего Востока [7, 8]. В результате исследования как ядерных, так и митохондриальных мар-
Институт проблем экологии и эволюции
им. А.Н. Северцова
Российской Академии наук, Москва
кёров было показано, что на территории Японии и в Южной Корее, помимо L. camtschaticum, обитают две уникальные формы миног — L. sp. N и L. sp. S., каждой из которых вполне может быть присвоен видовой статус на основании существенных генетических отличий от всех до сих пор изученных миног [7]. В то же время L. kessleri и L. reissneri, описанные в качестве самостоятельных видов, продемонстрировали столь высокое генетическое сходство как ядерного, так и мито-хондриального геномов, что было предложено объединить эти виды в единый комплекс — L. reissneri complex [8].
Вопрос о генетических различиях между жилыми непаразитическими миногами L. reissneri complex и анадромным паразитическим видом L. camtschaticum до сих пор не изучен. Между тем он исключительно важен, поскольку не все исследователи согласны с тем, что особенности жизненной стратегии миног имеют наследственную природу [3, 4].
В настоящее время генетическую характеристику вида дают, как правило, на основании нук-леотидной последовательности гена субъединицы I цитохромоксидазы (COI) митохондриального генома (Barcoding). Показано, что в абсолютном большинстве случаев различия по этому локусу, даже между близкородственными видами хордовых, составляют более 2% [9]. В данной работе мы изучили последовательность фрагмента мтДНК длиной 1072 п.н., включающего частичную последовательность гена COI, для жилых и проходных миног одной и той же речной системы — системы р. Утхолок (Западная Камчатка).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Отлов миног во время нереста 2005 и 2006 гг. (май—июнь) проводили на нерестилищах при помощи электролова таким образом, чтобы в анализ попали совместно нерестящиеся особи разных форм. Локализация мест отлова миног
Рис. 1. Места отлова миног. 1 — нерестилище миног на р. Утхолок; 2 — нерестилище на р. Калкавеем; 3 — место поимки смолта; 4 — р. Мысмонт, место вылова личинок. Стрелкой обозначено положение речной системы на п-ове Камчатка.
показана на схеме, представленной на рис. 1. Видовая принадлежность миног, установленная на основании комплекса морфологических призна-
Таблица 1. Характеристика проб, использованных для изучения последовательности локуса COI мтДНК миног бассейна р. Утхолок
Место сбора материала Видовая принадлежность по комплексу морфологических и экологических признаков Год сбора материала
р. Утхолок L. camtschaticum 2005
р. Утхолок L. camtschaticum (smolt) 2005
р. Утхолок L. camtschaticum 2005
р. Утхолок » 2005
р. Утхолок L. reissneri complex 2005
р. Калкавеем L. camtschaticum 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем L. reissneri complex 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2005
р. Калкавеем » 2006
р. Мысмонт L. sp. (ammocoet) = (L. reiss- 2006
neri complex)
р. Мысмонт » 2006
р. Мысмонт » 2006
р. Мысмонт » 2006
р. Мысмонт » 2006
ков, имеющих систематическое значение [3], место и год отлова конкретных особей приведены в табл.1.
Наряду с 20 производителями и одним смол-том (особью, претерпевшей метаморфоз и мигрирующей на нагул в море) в анализ были взяты пять пескороек (личинок миног), принадлежность которых к жилой форме у нас не вызывает сомнений, поскольку в мелководном притоке (ручей Мысмонт), где они были отловлены, проходные паразитические миноги никогда не были отмечены, а пескоройки в свою очередь не мигрируют против течения на значительные расстояния.
Пробы тканей (обычно фрагмент плавника) для генетического анализа фиксировали 96%-ным этанолом (1 : 5). ДНК выделяли при помощи набора реагентов Diatom™ DNA Prep 200 (ООО "Лаборатория Изоген", Москва) согласно рекомендациям изготовителя.
В большинстве случаев анализируемый фрагмент мтДНК получали в виде двух перекрывающихся ПЦР-продуктов, обозначенных здесь как COI-1 (657 п.н.) и COI-2 (644 п.н.). При получении этих ПЦР-продуктов использовали пары праймеров LmpL6860 и LmpH7472, LmpL7340 и LmpH7933 соответственно [7]. Для тех случаев, когда ДНК исследуемых образцов оказывалась сильно деградированной, и получить ПЦР-про-дукты значительной длины не удавалось, были разработаны дополнительные внутренние прай-меры. Их использование в комбинации с перечисленными выше позволило получать укороченные перекрывающиеся ПЦР-продукты COI-1a (357 п.н.) и COI-1b (374 п.н.), COI-2a (359 п.н.) и COI-2b (354 п.н.) соответственно. Схема расположения праймеров на участке мтДНК, исследован-
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА СУБЪЕДИНИЦЫ
705
m CN
Г^ЧО ЧО ООО CN eNm
^чщ О mtn оо
CN
ЧО
m^r оо
"TT"
"TT"
"TT"
"TT"
m
7
0
oo сл
LmpL 6860 LmpCOI-lbF LmpL 7340 LmpCOI-2bF
COI
LmpCOI-la
LmpH 7472 LmpCOI-2aR LmpH 7933
COI-1
COI-2
COI-la
□
COI-lb
=1
COI-2a
□
COI-2b
Рис. 2. Схема отжига основных (черные стрелки) и дополнительных (белые стрелки) праймеров в пределах локуса COI мтДНК. Вверху дана условная шкала (без соблюдения масштаба), на которой приведены положения первого и последнего нуклеотида каждого праймера на последовательности, секвенированной в данной работе. Внизу показаны ПЦР-продукты, получаемые при использовании различных пар праймеров (черный цвет — только основных, белый цвет — основных и дополнительных).
ном в настоящей работе, представлена на рис. 2. Последовательности всех праймеров приведены в табл. 2.
Во всех случаях ПЦР-продукты получали на амплификаторе "Терцик" (производство "ДНК-технология", Москва). Амплификацию проводили в 25 мкл буфера производства фирмы "Fermentas" (75 мМ Tris-HCl (pH 8.8), 20 мМ (NH4)2SO4, 0.1% Tween 20, 2 мМ MgCl2). Смесь для амплификации содержала около 300 нг тотальной клеточной ДНК, по 200 нмоль каждого из четырех дез-
оксирибонуклетидов, по 10 пмоль прямого и обратного праймеров и 0.5—0.7 ед. Тад-полимеразы (производство "Бионэм", Москва). Для предотвращения испарения в ходе реакции сверху на смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации включала в себя этап первоначальной денатурации ДНК (95°С, 4 мин), 30 циклов синтеза ПЦР-продукта (95°С - 45 с, 54°С - 45 с, 72° С — 1 мин), а также этап конечной элонгации цепи (72°С, 5 мин).
Таблица 2. Праймеры, использованные для получения ПЦР-продуктов и секвенирования локуса COI мтДНК миног
Праймер Последовательность нуклеотидов Источник
LmpL 6860 5'-GGCTTTGGCAACTGACTTGTACC-3' [7]
LmpCOI-bR 5'-GAGGACTGCAGTAATTAAAACGGATC-3' В этой работе
LmpCOI-1bF 5'-TAAARCCYCCAACTATAACACAATACC-3' В этой работе
LmpH 7472 5 '-TACTGTGAATATGTGRTGGGCTC - 3' [7]
LmpL 7340 5'-TGATTTTTTGGTCACCCTGAAGTTTA-3' [7]
LmpCOI-2aR 5'-CCGGTRAGTCCYCCTACAGTRAATAAG-3' В этой работе
LmpCOI-2bF 5'-ATGACACACCCCCATACTATGRGC-3' В этой работе
LmpH 7933 5' - CATGTAGTGTATGCATCAGGGTARTC - 3' [7]
Таблица 3. Положение вариабельных нуклеотидов в последовательности локуса COI мтДНК у миног бассейна р. Утхолок
Видовая принадлежность особей по комплексу морфологических и экологических признаков Положение вариабельного нуклеотида № последовательности в GenBank
304 451 775 1036 1057
L. camtschaticum A G A T A HQ686281
L. camtschaticum (smolt) T A A T G HQ686282
L. camtschaticum T G A T A HQ686283
L. camtschaticum A G A T A HQ686284
L. reissneri complex T G A T A HQ686285
L. camtschaticum Т G A T G HQ686286
L. camtschaticum T G A T A HQ686287
L. camtschaticum T G A T G HQ686288
L. camtschaticum T G A T G HQ686289
L. camtschaticum T G A T G HQ686290
L. reissneri complex T G A T A HQ686291
L. reissneri complex T G A T A HQ686292
L. reissneri complex T G A T A HQ686293
L. reissneri complex T G A T A HQ686294
L. reissneri complex A G A T A HQ686295
L. reissneri complex A G A T A HQ686296
L. reissneri complex T A A T G HQ686297
L. reissneri complex T G A T G HQ686298
L. reissneri complex T G A C G HQ686299
L. reissneri complex T G A T A HQ686300
L. reissneri complex A G A T A HQ686301
L. sp. (ammocoet)=(L. reissneri complex
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.