ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 1, с. 59-64
ФИЗИОЛОГИЯ ^^^^^^^^^^^^^^ РАЗВИТИЯ
УДК 591.147.6
ПОСТНАТАЛЬНОЕ СТАНОВЛЕНИЕ КОРТИКОСТЕРОИДНОЙ ФУНКЦИИ НАДПОЧЕЧНИКОВ У МЫШЕЙ C57BL/6J-A^ 1
© 2007 г. А. Ю. Шевченко, Т. В. Яковлева, Е. Н. Макарова, Н. М. Бажан
Институт цитологии и генетики СО РАН 630090 Новосибирск, пр-т Лаврентьева, д. 10 E-mail: antonyna-sh@yandex.ru Поступила в редакцию 27.02.06 г. Окончательный вариант получен 02.05.06 г.
Исследовано постнатальное становление кортикостероидной функции надпочечников у мышей во время периода повышенной активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и влияние на него мутантного генаAy. Показано, что у 3-недельных мышей в норме наблюдается пик кор-тикостерона в крови, повышенный базальный и стимулированный стероидогенез in vitro. У мышей Ay/a (гиперэкспрессия белка агути) по сравнению с мышами a/a (отсутствие белка агути) в возрасте 3 нед снижен пик кортикостерона в крови и отсутствуют генотипические различия в стероидогенезе in vitro, а в возрасте 10 и 15 нед нет генотипических различий по уровню кортикостерона в крови и повышен стероидогенез in vitro. Таким образом, у мышей высокий уровень кортикостерона в период повышенной активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы на 3-й нед жизни обусловлен усилением стероидогенной функции надпочечника. Мутантный ген Ay у самцов мышей нарушает постнатальное становление функции надпочечника - снижает величину пика кортикостерона в крови во время периода повышенной активности системы.
Ключевые слова: белок агути, кортикостерон, постнатальный онтогенез, надпочечник.
Становление функции гипоталамо-гипофи-зарно-надпочечниковой системы (ГГНС) у незре-лорождающих видов, к которым относятся крысы и мыши, происходит главным образом в раннем постнатальном периоде развития (Owen et al., 2005). У мышей и крыс в первый месяц жизни уровень кортикостерона в крови, являющийся интегральным показателем активности ГГНС, изменяется с возрастом, отражая закономерности развития ГГНС. В постнатальном становлении ГГНС можно выделить два периода: период низкой активности, названный стресс-гипореспон-сивным, когда уровень кортикостерона в крови очень низкий и отсутствует кортикостероидная реакция на стресс; и второй, следующий за ним период повышенной активности системы, характеризующийся значительным повышением ба-зального и стрессорного уровней кортикостерона (Diez et al., 1976; Шаляпина и др., 1982; Оськина и др., 2000). В современных работах по постна-тальному становлению ГГНС у млекопитающих внимание уделяется только первому периоду (стресс-гипореспонсивному) как критическому в становлении функции всей системы. Механизмы, лежащие в основе стресс-гипореспонсивного периода, до конца не выяснены, но показано, что он
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 04-04-48760).
обусловлен изменениями на уровне как центральных звеньев ГГНС (Schmidt et al., 2003, 2005), так и периферического звена - надпочечника (Yoshimura et al., 2003).
Период повышенной активности ГГНС менее изучен, однако обнаружено, что стрессорные воздействия в это время приводят к значительным изменениям активности ГГНС взрослых крыс (Edwards et al., 1999; Ordyan et al., 2001). По-видимому, у мышей повышенная активность в этот период не связана с активацией центральных звеньев, поскольку не сопровождается увеличением уровня адренокортикотропного гормона (АКТГ) в крови (Schmidt et al., 2003). Возможно, причиной является изменение активности надпочечников.
Стероидогенная функция надпочечника регулируется многими факторами. Недавно было показано, что паракринными регуляторами стерои-догенеза могут быть белки семейства агути (Dhil-lo et al., 2003; Doghman et al., 2004; Shevchenko et al., 2004; Dhillo et al., 2005). Одним из представителей этого семейства является белок агути (Ollmann et al., 1997). Доминантные мутации локуса agouti, в частности Ay, у мыши приводят к неконтролируемой гиперэкспрессии белка агути во всех тканях (Duhl et al., 1994; Carroll et al., 2004). В экспериментах in vivo и in vitro показано, что повсеместная гиперэкспрессия белка агути повышает актив-
Рис. 1. Динамика возрастных изменений веса тела мышей Ay/a (-0-) и a/a (-•-).
По оси абсцисс - возраст, нед; по оси ординат - вес тела, г. ** p < 0.01, *** p < 0.001 - мыши Ay/a по сравнению с мышами a/a - тест Ньюмена-Кёлса.
ность ГГНС взрослых мышей, причем белок агути, по-видимому, влияет не на центральные звенья системы, а на периферическое звено - надпочечник (Harris et al., 2001; Каркаева и др., 2003; Bazhan et al., 2004; Shevchenko et al., 2004). Возможно, изменение стероидогенеза у взрослых мышей с гиперэкспрессией белка агути обусловлено влиянием этого белка на становление функции надпочечника в раннем постнатальном онтогенезе, а именно в период повышенной активности ГГНС.
Цель нашей работы - исследование постна-тального становления кортикостероидной функции надпочечников у мышей во время периода повышенной активности ГГНС и влияние на него мутантного гена Ay, приводящего к повсеместной гиперэкспрессии белка агути. У мышей в первый месяц жизни и после полового созревания оценивали: 1) уровень кортикостерона в крови в состоянии покоя in vivo, 2) базальную и стимулированную секрецию кортикостерона клетками надпочечников in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Эксперименты проводили на мышах линии C57BL/6J. В качестве модели повсеместной гиперэкспрессии белка агути использованы мыши той же линии, несущие доминантный мутантный ген Ay (Ay/a). В норме мыши линии C57BL/6J, имеющие генотип a/a, характеризуются полным отсутствием продукции белка агути. Мыши a/a были использованы в качестве контроля при сравнении с мышами Ay/a.
В работе использованы самцы сибсы Ay/a (повсеместная гиперэкспрессия белка агути) и a/a (полное отсутствие экспрессии белка агути), полученные в скрещиваниях: Ay/a х a/a, a/a х Ay/a. Животных содержали в стандартных условиях ви-
вария Института цитологии и генетики СО РАН при свободном доступе к воде и пище и естественном освещении.
Доминантный мутантный ген Ay характеризуется множественными плейотропными эффектами, одним из которых является развитие с возрастом после полового созревания меланокортинового типа ожирения (Cone, 1999). В предварительном эксперименте (рис. 1) мы показали, что самцы Ay/a, при рождении не отличавшиеся по весу тела от самцов a/a, в 15 нед весят достоверно больше (p < 0.01). В экспериментах in vivo и in vitro участвовали молодые (1, 2, 3, 4-недельные), взрослые 10-недельные (когда мыши Ay/a и a/a еще достоверно не отличаются по весу тела) и 15-недель-ные самцы (когда у мышей Ay/a уже развивалось ожирение). Молодых самцов для экспериментов брали сразу из пометов без предварительной отсадки от матерей. Взрослых самцов за 4 сут до проведения экспериментов рассаживали по двое в отдельные клетки при свободном доступе к воде и пище.
После декапитации животных кровь собирали на холоду в пластиковые пробирки, содержащие растворенный в физиологическом растворе ЭДТА (1-2 мМ). Пробы крови центрифугировали в течение 15 мин при 4000 об/мин, 4°C. Образцы плазмы хранили при температуре -20°C.
Суспензию изолированных клеток надпочечников готовили согласно описанной ранее методике (Shevchenko et al., 2004). Аликвоты (0.2 мл) суспензии клеток, содержащие 4 х 105 кл/мл, помещали в пробирки и инкубировали в течение 2 ч в атмосфере 95% О2 и 5% СО2 в отсутствие или в присутствии стимулятора. В качестве стимулятора стероидогенеза использовали экзогенный АКТГ в физиологических концентрациях (10-13, 10-12, 10-11 М), сопоставимых с уровнем АКТГ в крови мышей, характерном для тонической стимуляции стероидогенеза в состоянии покоя in vivo (Bazhan et al., 2004). Затем пробы центрифугировали (5 мин при 2000 об/мин), а супернатант хранили при -20°C.
Определение уровня кортикостерона в плазме и суспензии клеток надпочечников проводили по методу конкурентного белкового связывания в модификации Тинникова и Бажан (1984).
Статистическая обработка. Полученные данные представлены в виде среднего ± ошибка среднего. В экспериментах in vivo в каждой возрастной группе было по 20-25 животных. В экспериментах in vitro каждая точка представляет среднее значение данных, полученных в трипли-катах в трех повторных экспериментах. Для выявления влияния факторов возраста и генотипа или дозы и генотипа использовали двухфактор-ный дисперсионный анализ АNOVA. Сравнение
отдельных выборок проводили с помощью теста Ньюмена-Кёлса.
Использованные реактивы (все фирмы "Sigma", США, за исключением указанных): раствор Кребса-Рингера (pH 7.4), бычий сывороточный альбумин (БСА), коллагеназа типа 1А (немеченый кортикостерон, АКТГ(1-39), меченный [3Н]кортикостерон ("Amersham", Англия).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Уровень кортикостерона в крови зависит от возраста (F(516055) = 34.7,p < 0.001): у самцов обоих генотипов в течение первых 3 нед он повышается, достигая к 3-недельному возрасту максимальных значений, а затем постепенно снижается (рис. 2). Агути-генотип влияет на динамику возрастных изменений уровня кортикостерона, о чем свидетельствует достоверное взаимодействие факторов возраста и генотипа (F(5.1566) = 3.38,p < 0.01). У самцов a/a к возрасту 3 нед концентрация кортикостерона в крови повышается, а к 4-й нед уже снижается. У мышей Ay/a уровень кортикостерона в крови к 3-недельному возрасту повышается в меньшей степени по сравнению с мышами a/a, в результате чего он становится достоверно ниже, чем у 3-не-дельных мышей a/a (p < 0.001). Достоверное снижение уровня кортикостерона у мышей Ay/a наблюдалось только к 10-й нед.
Базальная секреция кортикостерона клетками надпочечников зависит от возраста (F(4.60) = 21.5, p < 0.001) и не зависит от генотипа (рис. 3). У животных всех возрастов, за исключением 3-недель-ных, секреция кортикостерона одинакова. В возрасте 3 нед у самцов обоих генотипов секреция кортикостерона значительно выше.
Экзогенный АКТГ стимулирует стероидоге-нез в клетках надпочечников самцов обоих генотипов всех возрастов (рис. 4). Об этом свидетельствует выявленное до
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.