ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 5, с. 522-528
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ =
УДК 577.3
ПОСТУПЛЕНИЕ Сa2+ ЧЕРЕЗ КАЛЬЦИЕВЫЕ КАНАЛЫ СaV1.3 В САТЕЛЛИТНЫХ КЛЕТКАХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН КРЫСЫ
© 2013 г. В. А. Почаев*, А. М. Красный**, ***, Н. Д. Озернюк*
*Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 26 **Институт медико-биологических проблем РАН, 123007Москва, Хорошевское ш., 76а ***Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии МЗ РФ, 117997Москва, ул. Академика Опарина, 4 E-mail: pochaev865@gmail.com Поступила в редакцию 14.11.2012 г.
Обнаружены потенциалзависимые кальциевые каналы L-типа Cav1.3 в сателлитных клетках, локализованных на мышечных волокнах. Установлено, что действие карбахола, возбуждающего никотиновые ацетилхолиновые рецепторы и вызывающего деполяризацию клеточной мембраны, приводило к активации этих каналов. При этом верапамил и амлодипин, селективные ингибиторы каналов L-типа, блокировали вход внеклеточного кальция в цитоплазму. Отмечено, что в бескальциевой среде карбахол не оказывал влияния на концентрацию кальция в цитополазме сателлитных клеток, тогда как адреналин вызывал выход кальция из внутриклеточных депо. Кроме того, поступление кальция в цитоплазму не подавлялось верапамилом и амлодипином при действии адреналина и но-радреналина в среде с кальцием, а ингибитор в2-адренорецепторов ICI-118551 значительно снижал рост концентрации цитоплазматического кальция.
DOI: 10.7868/S0002332913050123
Кальциевые каналы L-типа относятся к наиболее изученным потенциалзависимым ионным каналам. Впервые они охарактеризованы в скелетных, сердечных и гладкомышечных клетках, где продемонстрировано их участие в сопряжении процессов возбуждения и сокращения мышцы, заключающееся в высвобождении ионов кальция из ретикулума вследствие потенциалза-висимой активации каналов L-типа (Schneider, Chandler, 1973; Beam et al., 1989; Tanabe et al, 1990; Franzini-Armstrong, Protasi, 1997). Каналы Ca^.3 входят в семейство потенциалзависимых кальциевых каналов L-типа Ca^. 1—1.4. (Catterall et al., 2005). Изотипы Ca^.3 обнаружены в различных типах тканей: возбудимой, сенсорной, нейроэн-докринной (Zuccotti et al., 2011).
Поступление Са2+ как вторичного мессендже-ра через каналы Ca^.3 играет ключевую роль в регуляции различных внутриклеточных процессов, в активации генов при развитии нервных клеток центрального слухового пути (Hirtz et al., 2011), а также в дифференцировке волосковых клеток улитки (Brandt et al., 2003; Glueckert et al., 2003; Michna et al., 2003; Nemzou et al., 2006). Диффе-ренцировка кардиомиоцитов также связана с каналами Ca^.3, обнаруженными в клетках предсердия и желудочка в эмбриональном и неона-тальном периодах развития. У взрослых особей
они были выявлены только в клетках предсердия (ри et а1, 2011).
В соответствии с многофункциональностью каналов Са¥1.3 существуют различные пути их активации и деактивации. Протеинкиназа А способна активировать эти каналы, инициируя вход Са2+ (8ето et а1., 1992; ри et а1, 2005Ь; Mahapatra et а1, 2012). Фосфорилирование другими киназа-ми (протеинкиназы О и С), наоборот, ингибирует кальциевый ток по этим каналам (McHugh et а1., 2000; Baroudi et а1., 2006; ^Ыпе et а1., 2008; Ma-hapatra etа1., 2012). В клетках синоатриальной области и поджелудочной железы каналы Cav1.3 демонстрируют высокую степень кальцийзависи-мой инактивации, тогда как в волосковых клетках улитки эта инактивация намного менее выражена или отсутствует (Yang, Ве^геп, 2006).
Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы формируют лиганд-управляемые ионные каналы в плазматической мембране некоторых нейронов и в постсинаптической мембране нервно-мышечного синапса. Эти рецепторы были обнаружены также в пролиферирующих миобластах, но не в сателлитных клетках (ЕП^зАе et а1., 1988а, Ь; Кгаше et а1., 1995). В результате активации данных рецепторов возникает волна деполяризации клеточной мембраны, приводящая к открытию потенциалзависимых кальциевых каналов.
Однако механизмы кальциевой сигнализации в сателлитных клетках, являющихся начальным этапом дифференцировки мышечных волокон, исследованы недостаточно. Сведения о физиологических особенностях мышечных клеток на начальных этапах дифференцировки, приводимые в литературе, получены главным образом при исследовании первичных культур сателлитных клеток и линий миобластов (Kislinger et al., 2005).
Цель работы — изучение сателлитных клеток, локализованных на единичных изолированных мышечных волокнах для установления наличия каналов Са^Д.3 и их связи с никотиновыми аце-тилхолиновыми рецепторами, а также изучение некоторых особенностей кальциевого метаболизма сателлитных клеток на стадии пролифератив-ного покоя в более характерном для них микроокружении по сравнению с клеточными культурами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования были мышечные волокна, изолированные из мышц задней конечности (m. flexor digitorum brevis — короткий сгибатель пальцев) крысы в возрасте 8—12 недель методом энзиматического расщепления с помощью и коллагеназы I, и диспазы. Мышечные волокна культивировались на полистирольном пластике.
Выделение мышечных волокон. Короткий сгибатель пальцев вырезался хирургическим путем из задних конечностей крысы. Целая мышца инкубировалась 1.5—2 ч в растворе, приготовленном на среде Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (ПанЭко, Россия) и содержавшем по 0.2% коллагеназы I (ПанЭко) и диспазы (Sigma-Aldrich, США). После ферментативной обработки диссоциацию волокон проводили перемешиванием с помощью пастеровской пипетки. Для прикрепления выделенных волокон к дну планшета их оставляли в инкубаторе на 30—40 мин при 37°С. Затем волокна либо фиксировались для им-муноцитохимических исследований, либо инкубировались в растворе кальциевого красителя Fluo-3 (Invitrogen, США). Весь процесс выделения и подготовки волокон для последующего анализа занимал менее 3 ч.
Исследование потоков кальция на окрашенных с помощью Fluo-3 мышечных волокнах. Изолированные волокна, прикрепленные к пластиковому планшету, промывались раствором Хэнкса (ПанЭко), содержавшим 1.3 мМ Са2+ с добавлением 0.5% Hepes (ПанЭко) (рН 7.4). Волокна инкубировались в приготовленной на растворе Хэнкса смеси кальциевого красителя Fluo-3 (10 мкг/мл) (Invitrogen) и детергента Pluronic F-127 (0.8 мкг/мл) (Invitrogen) в течение 40 мин. Измерения флуоресценции проводили в 48-лу-
ночном планшете на инвертированном флуоресцентном микроскопе DMI6000 Live (Leica, Германия), оснащенном камерой DFC360 FX (Leica) и набором объективов с увеличенным рабочим отрезком (коррекция сферической аберрации в диапазоне 0—2 мм). Изображения обрабатывались и анализировались с помощью стандартного программного обеспечения фирмы LAS AF 2.4.1 (Leica) с набором соответствующих пакетов. При этом качественно оценивалась интегральная интенсивность флуоресценции по выделенной области интереса на изображении.
Для характеристики метаболизма Са2+ в сателлитных клетках их инкубировали 10—15 мин при 37°С с 10 мкМ растворами селективных ингибиторов каналов L-типа (верапамилом и амлодипи-ном), а также с 0.1 мкМ раствором ингибитора ß2-адренорецепторов ICI-118551 (Sigma-Aldrich). В качестве первичных мессенджеров использовались 0.1—1 мМ растворы карбахола (Sigma-Ald-rich), 10 мкМ адреналина (Sigma-Aldrich) и 1 мкМ норадреналина (Sigma-Aldrich). Все агенты для каждого эксперимента готовились заново. Для экспериментов в бескальциевой среде первоначальный раствор Хэнкса (с кальцием) заменялся на бескальциевый (Invitrogen). Каждый эксперимент был проведен не менее 10 раз.
Иммуноцитохимия. Для проведения иммуно-химического анализа сателлитных клеток изолированные единичные мышечные волокна, прикрепленные к дну планшета, фиксировали 4%-ным раствором формальдегида в течение 10 мин при комнатной температуре, затем промывали 0.01 М раствором фосфатно-солевого буфера (pH 7.3—7.5) и пермеабилизировали 0.2%-ным раствором Triton X-100 в течение 20 мин. Неспецифическое связывание антител блокировали инкубацией в течение 30 мин в 4%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Ald-rich). Были использованы антитела против транскрипционного фактора Pax7 (R&D Systems, Великобритания) и белка клеточной адгезии М-кадге-рина (Abcam, Великобритания) в разведении 1 : 50. Для выявления в сателлитных клетках кальциевых каналов Cav1.3 было проведено окрашивание антителами против субъединицы a1D (разведение 1 : 20) этих каналов. Рабочие разведения первичных антител были определены титрованием.
В качестве вторичных антител использовали козьи антитела против мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (Invitrogen), и против кролика, конъюгированные с Alexa Fluor 647 (Invitrogen). Для окрашивания ядер клеток использовали Hoechst 33342 (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich).
Связывание с первичными антителами проходило в течение 1.5—2 ч при 37°С или 10—12 ч (в среду добавляли 0.02%-ный азид натрия) при 4°С. Инкубация со вторыми антителами происходила
524
ПОЧАЕВ и др.
(а) 10 мкм | | 1 (б) 10 мкм 1 1
1 1 (в) К | 10 мкм | | (г) • '. * 1 * * 10 мкм ■| |
i (д) t f: \ 10 мкм | | 1 у (е) 10 мкм | |
1 \ * (ж) 10 мкм | 1 (з) 10 мкм | |
Рис. 1. Сателлитные клетки на единичных мышечных волокнах. Проходящий свет (а, д); окраска ядерным красителем Hoechst 33342 (б, е); иммуноцитохимиче-ское выявление: транскрипционного фактора Pax7 (в), белка клеточной адгезии М-кадгерина (ж), субъединицы a1D кальциевого канала Cav1.3 (г, з). Конфокальная микроскопия.
в течение 1—1.5 ч при 37°С. Отмывка от первых и вторых антител проводилась 4 раза по 10 мин в фосфатно-солевом буфере при комнатной температуре. По окончании последней отмывки волокна отделялись от планшета с помощью активного пипетирования, осаждались центрифугированием и переносились на предметное стекло с сили-
коновыми бортиками или чашку Петри со стеклянным дном для дальнейшего анализа под микроскопом. Готовые препараты заключали под покровные стекла в глицерин.
Для контроля специфичности окрашивания при исследовании экспрессии Pax-7 и М-кадгери-на была использована обработка только вторичными
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.