ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 4, с. 424-432
= ЭКОЛОГИЯ =
УДК 549.252:576.851.13:581.191
ПОСТУПЛЕНИЕ СВИНЦА В РАСТЕНИЯ ИЗ ЗАГРЯЗНЕННОЙ ТЯЖЕЛЫМ МЕТАЛЛОМ ПОЧВЫ ПРИ ИНОКУЛЯЦИИ РОСТСТИМУЛИРУЮЩИМИ
РИЗОСФЕРНЫМИ БАКТЕРИЯМИ © 2014 г. В. П. Шабаев
Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, 142290 Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 2 E-mail: VPSH@rambler.ru Поступила в редакцию 02.07.2013 г.
В вегетационных опытах изучено влияние ростстимулирующих ризосферных бактерий рода Pseudomonas на рост и элементный состав растений ячменя при искусственном загрязнении почвы водорастворимыми соединениями свинца. Установлено, что инокуляция бактериями снижала поступление Pb в растения в первой половине вегетационного периода вследствие связывания тяжелого металла в составе органических соединений и стабильных комплексов в ризосферной почве без изменений реакции почвенной среды. Обнаружено, что штамм бактерии P. fluorescens 21 обладал максимальной способностью к иммобилизации Pb и способствовал минимальному поступлению металла в растения. Отмечено, что применение P. fluorescens 21 устранило токсичность Pb и повысило массу растений до уровня, которого она достигала на незагрязненной почве.
DOI: 10.7868/S0002332914040110
Свинец в повышенных концентрациях — один из наиболее опасных и распространенных токсичных загрязнителей биосферы — негативно воздействует на живые организмы и природные экосистемы. Pb попадает в почву как с промышленными и бытовыми отходами, так и с минеральными, главным образом фосфорными, удобрениями. Избыточное накопление Pb ингибирует метаболические процессы в растениях, подавляя дыхание и фотосинтез, и, как следствие, угнетает ростовые процессы. Попадание этого тяжелого металла в организм человека с загрязненной растительной продукцией по трофическим цепям приводит к различным заболеваниям, в том числе к расстройству нервной системы. Поступившие в организм теплокровных тяжелые металлы, в том числе Pb, преимущественно накапливаются в печени и выводятся крайне медленно, обусловливая кумулятивный эффект, приводящий к постепенному увеличению содержания тяжелых металлов в организме (Загрязнение почв..., 2008). Показано, что под влиянием Pb происходят окислительные повреждения ДНК в клетке в результате увеличения содержания оксидантов и свободных радикалов (Hong et al., 2007). Это может быть причиной индуцируемых ионами Pb генотоксич-ности и канцерогенеза (Yang et al., 1996, 1999).
В последнее десятилетие в качестве одного из альтернативных путей уменьшения токсичности тяжелых металлов для растений и ремедиации загрязненных почв многими исследователями рассматривается возможность использования стиму-
лирующих рост растений ризосферных микроорганизмов (Назаров, Иларионов, 2005; Denton, 2007; Lebeau et al, 2008; Khan et al., 2009). Микроорганизмы, ассоциированные с корнями высших растений, могут значительно повышать их устойчивость к неблагоприятным факторам среды благодаря различным механизмам, участвующим во взаимодействии растение—микроорганизм. Рост-стимулирующие ризосферные бактерии оказывают положительное влияние на растения вследствие образования антибиотиков, подавляющих фитопатогенные микроорганизмы (Смирнов, Киприанова, 1990; Glick, 1995), и продукции гормонов роста — ауксинов, гиббереллинов, цитоки-нинов и др. (Glick, 1995; Олюнина, Шабаев, 1996). Кроме того, эти бактерии стимулируют рост растений вследствие растворения труднодоступных соединений (фосфатов) и увеличения поглощения растениями питательных элементов из почвы (Glick, 1995; Шабаев и др. 1999), усиления азотфиксации и улучшения азотного питания растений (Glick, 1995; Шабаев, 2006), а также образования сидерофоров (железосвязывающих соединений) (Kloepper et al., 1989; Смирнов, Ки-прианова, 1990), защиты растений от токсичных тяжелых металлов (Lebeau et al., 2008).
В многочисленных исследованиях поглощения металлов растениями часто игнорируется вклад в процессы поступления металлов в растения почвенных микроорганизмов, которые участвуют в превращениях всех элементов, имеющихся в земной коре, оказывая влияние на изме-
нение их формы, подвижности и токсичности. Однако тяжелые металлы не подвергаются биодеградации и достаточно легко аккумулируются в живых системах, в том числе в микроорганизмах. Резистентные к тяжелым металлам бактерии способны к аккумуляции или биосорбции токсичных металлов в результате их связывания на поверхности клетки, поглощения внутрь клетки и связывания внеклеточными полимерными веществами. Следовательно, такие бактерии вносят значительный вклад в детоксикацию загрязненных сред (Микроэлементы..., 2009). Несмотря на то что ризосферные микроорганизмы играют существенную роль во взаимодействии растений с почвенной средой, проведено недостаточно исследований устойчивости растений к токсическому действию тяжелых металлов, в частности к повышенным концентрациям Pb, при применении этих микроорганизмов.
Цель работы — исследование влияния ростстиму-лирующих ризосферных бактерий рода Pseudomonas на рост растений ячменя, поступление в растения и состав соединений Pb в серой лесной почве при искусственном загрязнении водорастворимыми соединениями тяжелого металла.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования были штаммы бактерий Pseudomonas fluorescens 20, P. fluorescens 21 и P. putida 23, которые стимулировали рост и повышали биомассу различных культурных растений (Шабаев, 2006).
Устойчивость бактерий к Pb оценивали по их росту при культивировании в течение 24 ч при 28°С на агаризованной питательной среде Кинг Б (г/л): пептон — 20, глицерин — 8, K2HPO4 — 1.5, MgSO4 • 7H2O - 1.5, агар - 20, pH 7.2, с добавлением Pb(NO3)2 (Merck, Германия) в концентрациях 0-1000 мг Pb/л с интервалами 100 мг/л. Для определения биоиммобилизации Pb бактерии выращивали в режиме периодического культивирования в течение 18 ч при 28°С в 100 мл жидкой среды Кинг Б, содержавшей 100 мг Pb/л. Суспензии бактерий после выращивания центрифугировали при 8000 g и 0°C и отделяли от культураль-ной жидкости. Биомассу бактерий промывали двукратно дистиллированной водой, ресуспензи-ровали в воде, после чего измеряли оптическую плотность суспензий при 540 нм.
Ячмень (Hordeum vulgare L.) Московский 2 выращивали в сосудах на бывшей пахотной серой лесной почве, находившейся в условиях залежи в течение последних 4-6 лет на опытно-полевой станции института.
Опыт 1. В сосудах диаметром и высотой 7 см, наполненных 200 г почвы, выращивали по 5 растений в течение 14 сут до фазы кущения. В одном
варианте их выращивали при внесении РЬ без инокуляции бактериями, в двух других — при внесении РЬ и инокуляции штаммами бактерий P. fluorescens 20 или P. putida 23.
Опыт 2. В сосудах диаметром 7 и высотой 10 см, наполненных 500 г почвы, выращивали по 6 растений в течение 30 сут до фазы трубкования. В одном варианте их выращивали при при внесении РЬ без инокуляции бактериями, в другом — при внесении РЬ и инокуляции штаммом бактерии P. Аио^сет 21.
Опыт 3. В сосудах диаметром 10 и высотой 11 см, наполненных 800 г почвы, выращивали по 5 растений в течение 45 сут до фазы колошения. В одном варианте растения выращивали без внесения РЬ и без инокуляции бактериями, в трех других — на фоне загрязнения почвы РЬ без инокуляции бактериями и при инокуляции штаммами бактерии Р. Аио^сет 20 и Р. Аио^сет 21.
Опыт 4. В сосудах, содержавших 5 кг почвы, выращивали по 12 растений до фазы колошения на фоне загрязнения почвы РЬ без инокуляции и при инокуляции штаммом бактерии Р. fluorescens 21.
Повторность опытов 1 и 2 трехкратная, 3 и 4 — четырехкратная. В опыте 1 в почву вносили химически чистый РЬ(СН3СОО)2 (Реахим, Россия) из расчета 300 мг РЬ/кг, в опытах 2—4 — РЬ^03)2 (Мегск) из расчета 200 мг РЬ/кг почвы. В почву перед посевом семян вносили NPK-удобрения из расчета по 80 (опыт 4) и 100 мг (опыты 1—3) действующего вещества на 1 кг почвы соответственно в виде азотно-кислого аммония, двузамещен-ного фосфорно-кислого калия и серно-кислого калия. В опыте 3 варианты выравнивали по количеству внесенного в почву азота, добавляя в вариантах с загрязнением РЬ^03)2 дополнительное количество азотно-кислого аммония и таким образом доводя дозу азота до такого же уровня, как в варианте без внесения РЬ и инокуляции. После внесения солей почву увлажняли и выдерживали в сосудах в течение 10 сут. Семена при посеве ино-кулировали водными суспензиями чистых культур бактерий из расчета 108 клеток на растение. В вариантах без инокуляции вносили адекватное количество автоклавированной бактериальной суспензии. Влажность почвы в сосудах в течение вегетационного периода поддерживали на уровне не ниже 60% полной влагоемкости.
Вегетативную массу растений срезали, корни отмывали от почвы водой. Растительный материал высушивали при 70°С. В вегетативной массе и корнях растений, биомассе и культуральной жидкости бактерий после их выращивания определяли содержание РЬ. В опытах 2 и 3 после выращивания растений определяли содержание РЬ в воздушно-сухой почве в вытяжке 1 N ацетатно-аммонийного буферного раствора с рН 4.8 (Теория..., 2006). В опыте 3 после срезания растений
Таблица 1. Иммобилизация Pb бактериальными клетками
Pb
Бактерия бактериальные клетки культуральная жидкость
мг % внесенного количества мг % внесенного количества
P. fluorescens 20 55 55 45 45
P. fluorescens 21 65 65 35 35
P. putida 23 55 55 45 45
в фазе колошения фракционировали соединения Pb в почве методом последовательных селективных вытяжек (Теория..., 2006). Выделяли следующие фракции Pb: обменную (экстрагент Са^03)2), специфически сорбированную с карбонатами (CH3COOH), связанную с органическим веществом (K4P2O7) и с железистыми минералами (реактив Тамма). В опыте 3 определяли еще макро- и микроэлементы в растительном материале после мокрого озоления 1 г образца в смеси концентрированных кислот HNO3 и HClO4 (2 : 1). Содержание Pb и зольных элементов определяли на спектрометре ISP OES Optima 5900 DV (Perkin Elmer, США), калия — на пламенном фотометре Flapho 4 (Carl Zeiss, Германия). Содержание
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.