научная статья по теме ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫЕ КАТИОННЫЕ КАНАЛЫ, ФОРМИРУЕМЫЕ ПЕРОКСИРЕДОКСИНОМ-6 В ЛИПИДНОМ БИСЛОЕ Биология

Текст научной статьи на тему «ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫЕ КАТИОННЫЕ КАНАЛЫ, ФОРМИРУЕМЫЕ ПЕРОКСИРЕДОКСИНОМ-6 В ЛИПИДНОМ БИСЛОЕ»

БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 4, с. 696-699

= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =

УДК 577.3

ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИ СИМЫЕ КАТИОННЫЕ КАНАЛЫ, ФОРМИРУЕМЫЕ ПЕР ОКСИР ЕДОКСИНОМ-6 В ЛИПИДНОМ БИ СЛОЕ

© 2015 г. П.А. Григорьев, М.Г. Шарапов, В.И. Новоселов

Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская, 3

E-mail: greegorjev@mail.ru

Поступила в p едакцию 21.07.14 г. После доработки 19.05.15 г.

Впервые экспериментально показано, что антиоксидантный фермент пероксиредоксин-6 образует в липидном бислое из фосфатидихолина катион-селективные ионные каналы-кластеры. Канал-кластер как олигомерная структура состоит из трех и более субъединиц - каналов с проводимостью около 350 пСм в 200 мМ КC1. Среднее время открытого состояния канала-кластера уменьшается при повышении трансмембранного электрического потенциала. Рассмотрен молекулярный механизм инактивации канала-кластера.

Ключевые слова: ионные каналы, липидный бислой, потенциал-зависимая инактивация.

Пероксиредоксины (Ргх) - белки с молеку-ляр ным весом 20-30 кДа, важные антиоксидан-тые фер менты, котор ые широко пр едставлены во всем живом мире. Пероксиредоксины могут иметь различную локализацию в клетке и со -ставлять до 1% от р а створ имой формы белка в клетке [1]. Пероксиредоксины способны восстанавливать гидропероксиды как органической, так и неорганической пр ир оды [2-4]. К ро -ме пероксидазной активности, некоторые пероксиредоксины пр оявляют шаперонную и фос-фолипазную активность [5].

Пероксиредоксины по числу цистеинов в активном центре и особенностям механизма катализа разделены на три подсемейства: 1-Су8 Ргх, типичные 2-Су8 Ргх и атипичные 2-Су8 Ргх. У млекопитающих обнаружено шесть представителей семейства пер оксиредоксинов: Ргх1-Ргх4 (типичные 2-Су8 Ргх), Ргх5 (атипичные 2-Су8 Ргх) и Ргх6 (1-Сув Ргх).

Ргх6 - представитель 1-Су8 Ргх, содержащих единственный активный остаток цистеина (Су847).

Подобно другим пероксиредоксинам, Ргх6 восстанавливает пероксиды различной приро-ды, но помимо Н2О2, пероксинитрита и алкил-гидропер оксидов, способен восстанавливать пероксиды фосфолипидов [6,7]. При этом Ргх6 восстанавливает как свободные молекулы гид-ропероксидов жирных кислот, так и в со ставе

Сокращение: Prx - пероксиредоксины.

фосфолипидов [7,8]. Пероксидазный каталитический центр Prx6 формируется тремя высоко-консервативными остатками: His39, Cys47 и Arg132.

Биологическая активность Prx6 происходит в окружении клеточных мембр ан, и вполне вероятно - на их поверхности. Как известно, фосфолипидный бислой является обязательным составным структурным компонентом всех клеточных мембран. Поэтому вполне логичным является изучение взаимодействия Ргх6 с бис-лойной фосфолипидной мембраной, что и было выполнено в данной работе методом измерения проводимости мембраны в режиме фиксированного напряжения методом фиксации потенциала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали элетрофоретически чистые препараты (98% чистоты) белка Ргх6, методика получения которого детально описана в работе Шарапова и соавт. [9]. Необходимое количество Ргх6 добавляли в 12 мл объем электролита (100-200 мМ КС1) с одной стороны липидной мембраны, сформированной из фос-фатидилхолина (Р 5638, Sigma, США), так, чтобы окончательная концентрация Ргх6 в этом объеме была пример но 10-8 М. После 5-минутного перемешивания начинали измерение мембранного тока в режиме фиксации напряжения. Для записи и анализа токов каналов использовали прогр амму WinEDR 3.3.1 [10]. И споль-

ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИ СИМЫЕ КАТИОННЫЕ КАНАЛЫ

697

Рис. 1. Токи одиночных ионных каналов, формируемых пероксиредоксином-6 в липидном бислое. Условия: 200 мМ К С1, рН 7,0, напр яжение 57 мВ. Калибр овка: вер тикальная - 100 пА, гор изонталь-ная - 10 с.

Р ис. 2. Ток мембр аны пр и напряжении на мембр ане 20 мВ (верхняя ча сть р исунка) и пр и 88 мВ. Условия: 200 мМ К С1, рН 7,0. Калибр овки: вер тикальная -50 пА, горизонтальная - 100 с.

Рис. 3. Зависимость среднего времени открытого со стояния Ргх6-канала от напряжения.

зованный в работе метод реги стр ации мембр ан-ных токов детально описан в ряде публикаций (см., напр имер, работу Бор и совой и соавт. [11]).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Р ис. 4. Вольтампер ные хар актер истики ионных ка-налов-кластер ов, обр азуемых пер оксир едок сином-6: 1 - трехканальный кластер, 100 мМ КС1 по обе стор оны мембр аны, 2 - этот же кластер пр и гр а-диенте КС1 (300/100 мМ), 3 - четырехканальный кластер пр и гр адиенте К С1 (300/100 мМ). Потенциал нулевого тока для зависимостей 2 и 3 равен 30 мВ, что соответствует идеальной калиевой селективности всех открытых каналов.

На р ис. 1 показана запись тока мембр аны во вр емени, пр и напр яжении 57 мВ. Минимальная ступенька тока величиной в 20 пА соответствует откр ытию тр ансмембр анного канала проводимостью в 350 пСм). На записи тока видны импульсные увеличения тока величиной, кр атной 20 пА, - это одновр еменное откр ытие нескольких каналов. Вероятно, это включение кластера каналов.

Действительно, кластер ность встр аиваемых каналов отчетливо пр оявляется пр и повышенных напр яжениях. Напр имер, вид флуктуаций тока мембраны при напряжении в 88 мВ (рис. 2) существенно отличается от флуктуации пр и напряжении в 57 мВ (рис. 1). Канал, включенный при 57 мВ, практически не выключается, но пр и 88 мВ вр емена откр ытого со стояния зна -чительно короче. Видно, что выключающийся

кластер может со стоять из разного количества моноканалов с пр оводимостью в 360 п С м. Это отражается разным количеством ступенек отключения тока (см. р ис. 2). Существует распр е-деление вр емен отр ытого со стояния кластер а.

Количественно зависимость ср еднего вр емени откр ытого со стояния канала-кластер а пока -зана на р ис. 3.

Катион-анионная селективно сть каналов была определена в эксперименте, результаты котор ого пр иведены на рис. 4. Вольтампер ные хар актер истики 1 и 2 соответствуют ситуации, когда кластер, вер оятно, со стоит из шести моноканалов пр оводимостью пр имер но в 170 пС м. Действительно, с большой вероятностью можно ожидать, что проводимость канала, имеющего проводимость 350 пСм в 200 мМ КС1, будет р авна 175 п С м в 100 мМ К С1, а пр оводимость

698

ГРИГОРЬЕВ и др.

(а) (б)

Рис. 5. Вероятный механизм процесса инактивации Ргх6 канала-кластера. Предполагается, что олигомер из 10 и более молекул Ргх6 является более стабильной, долгоживущей внутри бислоя структурой, по сравнению с мономером. Вышедший из кластера канал (мономер Ргх6) покидает бислой под действием внешнего поля. Ток мембраны дискретно уменьшается.

в 1000 пСм (зависимости 1 и 2 на рис 4) соответствует проводимости шести таких моноканалов кластер а. Зависимость 1 была получена в симметричных по концентрации КС1 условиях (100 мМ) по обе стороны мембраны, а зависимость 2 - при трехкратном градиенте К С1 (300/100 мМ), 300 мМ - во внешнем отсеке, в котором измеряется потенциал относительно заземленного внутреннего отсека. Зависимость 3 соответствует случаю, когда при градиенте КС1 открыт дополнительный кластер при трехкратном градиенте концентрации К С1. Видно, что потенциал нулевого тока кривых 2 и 3 равен 30 мВ, это соответствует идеальной К+-селективности каналов.

Дискретно сть инактиктивации можно, веро -ятно, объяснить тем, что при пониженном (и даже нулевом) напряжении на мембране в бис-лой встраивается кластер, состоящий из нескольких мономеров Ргх6, и в момент включения напряжения регистрируется суммарный ток каналов кластера. При низком напряжении целостность кластера сохраняется долго, а при повышении напряжения проявляется ступенчатое уменьшение тока - выход из мембраны каналов-мономеров Ргх6 (рис. 5, справа). Действительно, с точки зр ения теории сольватации, олигомер, состоящий из нескольких молекул Ргх6, должен легче встраиваться в бислой, чем мономер. Энергия сольватации определяется уравнением Бор на [12,13]:

Е ~ q 2 (1 - 1/ е) / г,

где Е - энергия сольватации, q - заряд молекулы, е - диэлектрическая константа, г - радиус

молекулы. В данном случае рассматривается разность энер гий для двух сред, отличающихся по £: одна с е = 80, р а створ К C1, другая -гидрофобная часть липидного бислоя се = 2.

Наблюдаемую зависимость от трансмембранного потенциала скорости выхода из бислоя каналов-мономеров можно объяснить эффектом плавления олигомера - канала-кластера, так как плотности токов мембраны находятся в диапазоне нескольких сотен ампер на см2.

Таким образом, нами показано:

1. Ргх6 формирует в липидном бислое катион-селективные ионные каналы кластерной структуры.

2. Канал-кластер обладает потенциал-зависимой инактивацией проводимости.

3. Высказано предположение, что эффект «плавления» внутримембранного кластера и разница в энергиях сольватации олигомера и мономера Ргх6 могут быть физическими факторами, ответственными за инактивацию про -водимости канала-кластера.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, гранты № 13-94-00537 и № 1304-00763.

СПИС ОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. M. S. Seo, S. W. Kang, K. Kim, et al., J. Biol. Chem.

275, 20346 (2000).

2. B. Hofmann, H. H. Heeht, and L. Flohe, Biol. Chem.

383, 347 (2002).

3. Z. A. Wood, L. B. Boole, and Р. A. Ka^lus, Seienee

300, 650 (2003).

ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИ СИМЫЕ КАТИОННЫЕ КАНАЛЫ

699

4. A. Karplus and A. Hall, Subcell. Biochem. 44, 46 (2007).

5. H. H. Jang, K. O. Lee, Y. H. Chi, et al., Cell 117, 625-635 (2004).

6. J. W. Chen, C. Dodia, S. I. Feinstein, et al., J. Biol. Chem. 275, 28421 (2000).

7. Y. Manevich, T. Shuvaeva, C. Dodia, et al., Arch. Biochem. Biophys. 485, 139 (2009).

8. S. Y. Kim, H. Y. Jo, M. H. Kim, et al., J. Biol. Chem. 283, 33563 (2008).

9. М. Г. Шарапов, В. И. Новоселов и В. К. Раввин, Молекуляр. биология 43 (3), 505 (2009).

10. J. Demster, Strathclyde Electrophysiology Software Win EDR 3.2.2 (University of Strathclyde, 2014).

11. M. P. Borisova, E.A . Brutyan, and L. N. Ermishkin, J. Membrane Biol. 90 (1), 13 (1988)

12. M. Born, Zeitschrift fur Physik 1, 45 (1920)

13. N. Bazhin, Termodynamics 2012, Article ID 204104, 3 pages doi: 10.5402/2012/204104 (201

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком