БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2QQ9, том 26, № 4, с. 258-264
УДК 577.3
ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫЕ Са2+-КАНАЛЫ ВКУСОВЫХ
КЛЕТОК ТИПА III
© 2009 г. Р. Ä. Романов, Ю. Е. Яценко, Н. В. Кабанова, М. Ф. Быстрова, С. С. Колесников
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская обл., Пущино, Институтская, 3; факс: 8-(4967)-33-0509; электронная почта: cheglok@rambler.ru Поступила в редакцию 19.02.2009 г.
Гетерогенная популяция клеток вкусовой почки млекопитающих включает три морфологически различных типа клеток - тип I, тип II и тип III - которые также отличаются по своим электрофизиологическим характеристикам. Так потенциал-зависимые (ПЗ) Са2+-каналы функциональны лишь во вкусовых клетках типа III. В данной работе исследовали эти каналы в условиях, когда внеклеточный раствор содержал Bа2+ в качестве носителя тока. В частности было показано, что ПЗ Bа2+-токи практически полностью ингибируются нифедипином, а также ионными блокаторами, включая Cd2+, Nr2+ Co2+. Кинетические характеристики ПЗ Bа2+-токов во вкусовых клетках типа III и их чувствительность к блокаторам свидетельствовали о том, что они переносятся преимущественно через Са2+-каналы L-типа. Методами молекулярной биологии во вкусовых клетках исследовали экспрессию генов, кодирующих а1-субъеди-ницу, которая формирует пору ПЗ Са2+-каналов. Показано, что из четырех генов, кодирующих а1-субъ-единицы Са2+-каналов L-типа (Cav1.1-Cav14), вкусовые клетки экспрессируют лишь Cav1.2.
Ключевые слова: вкусовые клетки, потенциал-зависимый кальциевый канал, дигидропиридин.
Популяция клеток вкусовой почки млекопитающих гетерогенна и включает три морфологически различных типа веретенообразных вкусовых клеток - тип I, тип II и тип III - выполняющих хе-мосенсорную функцию [1-3]. Ранее нами было установлено, что вкусовые клетки этих трех типов отличаются по своим электрофизиологическим характеристикам, что может быть использовано для их однозначной идентификации в электрофизиологическом эксперименте, в котором морфологические критерии обычно не применимы [4, 5]. В частности, потенциал-зависимые (ПЗ) №+-каналы функциональны во вкусовых клетках типа II и III [4, 6], ПЗ Са2+-каналы найдены только в клетках типа III [4, 6, 7], ПЗ выходящие токи переносятся ^-каналами в клетках типа I и III [4, 6], тогда как эти токи в клетках типа II транспортируются неселективными ПЗ каналами, скорее всего формируемыми канальными белками из семейства коннексинов [8, 9]. Целью данной работы было охарактеризовать ПЗ Са2+-каналы во вкусовых клетках типа III.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Электрофизиология. Эксперименты проводили на одиночных вкусовых клетках, изолированных из желобоватого сосочка языка мыши (6-12 недель), как описано ранее [10]. Электрическую активность вкусовых клеток регистрировали методом patch clamp в конфигурации perforated
patch clamp с использованием усилителя Axopatch 200 B ("Axon Instruments", США), ЦАП-АЦП конвертера DigiData 1322A и пакета лицензионных программ pClamp8.0 (все "Axon Instruments", США). Электрофизиологическая камера и система перфузии описана ранее [11]. Регистрирующие пипетки заполняли растворами, содержащими (в мМ): 140 KCl/CsCl, 1 MgCl2, 0.5 EGTA, 10 HEPES-KOH (CsOH), pH 7.4, 400 мкг/мл амфотерицина Б. Базовый внеклеточный раствор содержал (в мМ): 140 NaCl, 2.5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES-NaOH, pH 7.4. Все соли и реагенты фирмы "Sigma—Aldrich" (США). Эксперименты проводили при комнатной температуре 23-25°С.
Фотометрия. Изменения цитозольного Са2+ во вкусовых клетках оценивали по флуоресценции Са2+-зонда Fluo-4, которую визуализировали с использованием микроскопа Axioscope-2, водно-иммерсионного объектива Achroplan-40, NA = 0.8 ("Zeiss", Германия) и ICCD-камеры IC-200 ("Photon Technology International", США). Для загрузки Са2+-зонда клетки инкубировали в присутствии мембрано-проникающего аналога Fluo-4AM (2-4 мкМ) с добавлением детергента pluronic (0.02%) (оба от "Molecular Probes", США) в течение 35 мин при комнатной температуре. Флуоресценцию Fluo-4 возбуждали при помощи осветителя на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах [12]. Излучение возбуждения и эмиссии фильтровалось интерференционными фильтрами ("Chroma", США) в полосе длин волн
480 ± 10 и 535 ± 20 нм соответственно. Последовательные флуоресцентные изображения клетки регистрировали каждые 0.5-2 с и анализировали при помощи программы ImagingWorkBench 5.2 ("INDEC Biosystems", США).
Молекулярная биология. ОТ-ПЦР. Суммарную РНК выделяли из желобоватых сосочков языка и из сетчатки с помощью набора RNeasy Mini kit ("Qiagen", США), следуя инструкции производителя. Для синтеза первой цепи кДНК с РНК-матрицы использовали обратную тран-скриптазу SuperScriptIII ("Invitrogen", США) и олиго(дТ)-праймер. Для амплификации специфических участков кДНК Cav1.4 методом ПЦР использовали три пары ген-специфических прайме-ров (5'-TCTTTGCCATGCTAACTGT и 5'-TCT-GAAAGAGTGAGGAGG; 5'-GCCCTCCTCACTG-TCTTT и 5'-GCTGAAAGCACGTTGTCA; 5'-AT-GATGGCCCTGTTCACT и 5'-CTGCGGAAAG-GTCTGGAA), охватывающих участки от 993 до 2162 (1170 п. н.), от 2141 до 3276 (1136 п. н.) и от 3278 до 4165 п. н. (888 п. н.) соответственно. Прай-меры конструировали на основании нуклеотид-ной последовательности NM_019582.2 базы данных GenBank. Для анализа экспрессии во вкусовой ткани генов, кодирующих ах-субъединицы Са2+-каналов L-типа, методом ОТ-ПЦР (обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией) были использованы вырожденные праймеры, сконструированные на основании консервативных участков в аминокислотных последовательностях Cav1.1, Cav1.2 и Cav1.3: FFM-MNIFV и FISFYMLC [13]. Вырожденные праймеры на эти области: 5 '-TTYTTYATGATGA-AYATHTTYGT и 5'-ANAGCATRTARAARCTT-DATRAA, где S-C/G, R-A/G, Y-C/T, D- A/G/T, H-A/T/C, N-A/C/G/T. Ожидаемый размер фрагмента - 945 п. н. для Cav1.1, 927 п. н. для Cav1.2 и 933 п. н. для Cav1.3. Был использован следующий температурный режим: 95°С - 2 мин, далее 30 циклов 95°С - 20 с, 55°С - 20 с, 70°С - 60 c. Очищенный продукт ПЦР клонировали в векторе pGEM-T Easy ("Promega", США). Рекомбинант-ные плазмиды расщепляли рестриктазой EcoRI для подтверждения присутствия вставки, а также NcoI или BstXI для идентификации клонированного фрагмента ("Fermentas", Литва).
регистрировать относительно небольшие входящие токи через ПЗ Са2+-каналы. Когда клетки типа III перфузировали раствором, содержащим 140 мМ NaCl + 1 мМ Са02, их деполяризация вызывала быстрые входящие токи, блокируемые тетродотоксином (TTX), т.е. транспортируемые ПЗ №+-каналами, и медленно инактивирующие-ся входящие ПЗ Са2+-токи (рис. 1а). В этих условиях максимальная величина ПЗ Са2+-токов варьировала в пределах 10-50 пА, и примерно в 50% случаев (>100 клеток типа III) они были плохо разрешимы из-за электрических шумов. В то же время все клетки типа III, в которых одновременно регистрировались ионные токи и осуществлялся мониторинг Са2+ по флуоресценции Са2+-зонда Fluo-4 (n = 31), демонстрировали хорошо разрешимые скачки внутриклеточного Са2+, амплитуда которых зависела от величины деполяризующего потенциала (рис. 16). Это показывало, что ПЗ Са2+-каналы функциональны в большинстве (если не во всех) клеток типа III. Обычно Са2+-сигналы становились хорошо различимыми, начиная с -30 мВ, и достигали максимальной величины при -10 мВ (рис. 16), указывая на то, что ПЗ Са2+-токи переносятся преимущественно высокопороговыми ПЗ Са2+-каналами. В дальнейших экспериментах эти каналы исследовали в условиях, когда внеклеточные растворы содержали Ba2+ (10 мМ), который хорошо проникает через ПЗ Са2+-каналы всех типов и в присутствии которого устраняется инактивация Са2+-каналов, зависящая от входа наружного Са2+. Последнее, а также увеличение концентрации проникающего иона, позволяет существенно увеличить токи через ПЗ Са2+-каналы и улучшить их разрешение. Отметим, что в присутствии 10 hM Ba2+ в наружном растворе максимальный ток достигался около 0 мВ, что соответствует примерно 10 мВ сдвигу вольт-амперной характеристики Ва2+-токов через ПЗ Ca2+-каналы по сравнению с Са2+-тока-ми, наблюдаемыми при 1 мМ Са2+ (рис. 16). Подобный сдвиг, скорее всего, был вызван увеличением положительного поверхностного заряда в присутствии 10 mM Ba2+ во внеклеточной среде, что эквивалентно дополнительной гиперполяризации мембраны, и поэтому требовало большей деполяризации клетки для стимуляции ПЗ Ca2+-каналов по сравнению с контролем.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Физиологические исследования
Электрическую активность изолированных вкусовых клеток анализировали методом perforated patch [14] в условиях диализа клеток раствором, содержащим 140 мМ CsCl. В этих условиях были подавлены выходящие токи через ПЗ К+-каналы во вкусовых клетках типа III, что облегчало идентификацию последних [4] и позволяло
Эффекты блокаторов
Нифедипин. Отсутствие инактивации ПЗ Ba2+-токов (рис. 1г) скорее всего было связано с тем, что эти токи преимущественно переносятся ПЗ Ca2+-каналами L-типа. Последние специфически модулируются органическими веществами с ди-гидропиридиновым ядром [15], которые широко используются для идентификации и исследования Ca2+-токов L-типа. В наших экспериментах ПЗ
-10 мВ
-70 мВ
а -40 -30 -20
-70 мВ I I I
-10 0 10
20 30 40
Na
1 мин
AF/F0=0.2
- 70 мВ
-60 мВ
20 мс
-60-40-20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ
200 пА
0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0
-60-40-20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ
о
н + '
cs
а В
ы н н а
W
о р
и
м р
о
к
Рис. 1. ПЗ Са2+-каналы во вкусовых клетках типа III. а - Входящие Na+ (/Na, пунктирная кривая) и Ca (¡£а, тонкая линия) токи, регистрируемые от вкусовой клетки в ответ на 100 мс деполяризацию (верхняя панель) от -70 мВ до -10 мВ в условиях диализа раствором, содержащим 140 мМ CsCl, и перфузии раствором, содержащим 140 мМ NaCl + 1 мМ CaCl2. б - Изменения флуоресценции той же вкусовой клетки, окрашенной Fluo-4, вызванные входом наружного Са2+ через ПЗ Са2+-каналы, которые стимулировались 100 мс скачками мембранного потенциала, деполяризующими клетку до указанных значений (верхняя панель). Fq - интенсивность флуоресценции, измеренной непос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.