ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОМ ХИМИИ, 2007, том 62, № 12, с. 1309-1315
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.555.4+57.083.3
ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЙ ДНК-СЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОИММУННЫХ АНТИТЕЛ К ДНК
© 2007 г. А. В. Порфирьева*, Г. А. Евтшгин*, Е. Ю. Подшивалина**, Л. И. Анчикова**, Г. К. Будников*
*Химический институт им. А.М. Бутлерова Казанского государственного университета
420008 Казань, ул. Кремлевская, 18 **Казанская государственная медицинская академия 420012 Казань, ул. Муштари, 11 Поступила в редакцию 07.08.2006 г., после доработки 15.12.2006 г.
Предложен новый способ регистрации взаимодействий ДНК-аутоиммунные антитела к ДНК с помощью потенциометрического сенсора на основе стеклоуглеродного электрода, модифицированного полианилином и нативной ДНК эритроцитов цыплят. Как показано, взаимодействие антител с ДНК меняет скорость допирования полианилина при переносе ДНК-сенсора из щелочной среды (рН 7.5), оптимальной для иммунохимической реакции, в кислую (рН 3.0). Динамика изменения потенциала ДНК-сенсора зависит от титра антител и их происхождения. Зависимости сигнала ДНК-сенсора от разведения сывороток крови больных системной красной волчанкой и аутоиммунным тирео-идитом показывают возможность диагностики присутствия антител к ДНК по характерному максимуму на кривой разведения, регистрируемому в диапазоне разбавлений сыворотки 1 : 20 - 1 : 50.
Своевременная диагностика аутоиммунных заболеваний является актуальной проблемой современного биоанализа. Аутоиммунные заболевания поражают до 7% населения Земного шара. Женщины составляют до 90% заболевших, причем, как правило, в молодом возрасте [1]. Неясная этиология и многообразие факторов, определяющих течение аутоиммунных заболеваний, приводят к сложности их ранней диагностики, особенно на фоне неблагоприятного экологического фона и других стрессовых факторов. Так, по данным Центра изучения аутоиммунных заболеваний университета Флориды (США), первичный диагноз подтверждается только у 49% больных [2].
Одним из способов объективной оценки аутоиммунного статуса организма является обнаружение в крови больного аутоантител к нативной ДНК. У здоровых доноров такие аутоантитела, как правило, отсутствуют или же их количество весьма незначительно. В аутоиммунном процессе массовая гибель клеток в результате апопоптоза приводит к увеличению титра внеклеточной ДНК в кровотоке, что способствует продуцированию антител, выводящих избыток нуклеиновых кислот [3]. Антитела к нативной (двунитевой) ДНК обнаруживаются в крови пациентов с широким спектром аутоиммунных и некоторых вирусных заболеваний: системная красная волчанка, аутоиммунный гепатит, болезнь Грейвса, рассеянный склероз, синдром Шегрена, аутоиммунный тиреоидит, СПИД [4]. Установлена взаимосвязь
уровня антител к ДНК в крови больных системной красной волчанкой с клинико-иммунологиче-ской картиной заболевания [5]. В случае аутоиммунного тиреоидита присутствие антител к ДНК в сыворотке крови является вспомогательным признаком, позволяющим подтвердить диагноз и отличить данное заболевание от сходных патологий щитовидной железы [6].
Наиболее распространенным на сегодняшний день способом определения антител к ДНК в сыворотке крови является твердофазный иммуно-ферментный анализ (ИФА) [7]. Недостатком данного способа является то, что он основан на сложной многоступенчатой методике, требует больших затрат времени и применения токсичных реактивов. В связи с этим представляется актуальной разработка альтернативных способов обнаружения антител к ДНК, в том числе, использующих биосенсорные технологии.
Так, описан электрохимический вариант традиционного сандвичевого иммуноферментного анализа для определения антител к ДНК с укороченным временем инкубирования и отмывки [8]. Предложен способ определения антител к ДНК с помощью ферментного сенсора, в котором индикаторный фермент (холинэстераза или пероксида-за) иммобилизован совместно с ДНК в полимерной пленке [9, 10]. Взаимодействие ДНК с антителами увеличивает диффузионное торможение переноса субстрата из раствора к активному центру фермента и уменьшает скорость ферментативной реакции, регистрируемой амперометри-
чески. Иммуносенсор использован для обнаружения антител к ДНК в сыворотке крови больных системной красной волчанкой и для диагностики алеутской болезни норки.
Помимо индикаторных ферментов для регистрации взаимодействий ДНК-иммуноглобулин предложено использовать ферроцианид калия, сигнал которого уменьшается в присутствии антител к ДНК [11]. Двунитевую ДНК, модифицированную 2-гидроксиэтилдисульфидом по 5'-кон-цу, иммобилизовали на золотом электроде посредством сульфидных связей. Изменение тока окисления маркера связано с частичным экранированием отрицательного заряда нативной ДНК в процессе образования ее комплекса с белками.
Эффективным способом контроля электростатических взаимодействий в процессе связывания ДНК с высокомолекулярными лигандами может стать измерение электрохимических характеристик полианилина. ДНК, несущая отрицательный заряд фосфатного остова, образует полиионный комплекс с положительно заряженным полианилином, влияя на процессы переноса ионов водорода и низкомолекулярных ионов, сопровождающие окислительно-восстановительные превращения полимера. Комплексы ДНК-полианилин были успешно использованы для создания ферментных сенсоров на основе ряда окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов [12-15]. В данной работе электрод, модифицированный полианилином, использовали для регистрации взаимодействий ДНК с аутоиммунными антителами, присутствующими в сыворотке крови больных рядом заболеваний.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Использовали высокополимерную дезоксирибо-нуклеиновую кислоту (ДНК) эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия), глутаровый альдегид ("Lancaster", Англия), ДНКазу I (Санкт-Петербургский мясокомбинат, Россия), адъювант Фрейнда полный и неполный ("Life Technologies Inc.", США). Сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом и системной красной волчанкой предоставлены кафедрой эндокринологии Казанской государственной медицинской академии. Сыворотки хранили в морозильной камере и размораживали однократно перед приготовлением их разбавленных растворов. Для определения антител к тиро-идной пероксидазе методом ИФА использовали тест-систему "Хема" (С.-Петербург).
Для приготовления растворов ДНК, разбавления сывороток, а также для потенциометрических измерений сигнала ДНК-сенсора использовали 0.001 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0.03 М Na2SO4. Электрополимеризацию анилина осуществляли в 0.2 М Н^04, приготовлен-
ной из фиксанала ч.д.а. разбавлением дистиллированной водой. Все другие реактивы были ч.д.а.
Электрополимеризацию проводили в нетермостатированной ячейке объемом 5 мл в 0.2 М H2SO4. Противоэлектродом служила никелевая фольга (S = 1 см2), электродом сравнения - хло-ридсеребряный электрод (Ag/AgCl). Сканирование потенциала и электрохимическую очистку электродов проводили с помощью вольтамперо-графа "Экотест-ВА" (ЗАО "Эконикс-Эксперт", Москва). Потенциометрические измерения проводили с помощью рН-метра-иономера "Экс-перт-001" ("Эконикс-Эксперт"). Электрохимический импеданс измеряли на электрохимическом анализаторе PGSTAT302, оснащенном модулем FRA-2 (версия 4.9004, "Eco-Chemie", Голландия). Диапазон частот от 100 кГц до 40 мГц, амплитуда 5 мВ, потенциал 0.7 В. Импеданс измеряли в присутствии 0.01 М K3[Fe(CN)6] и 0.01 М K4[Fe(CN)6].
Иммунизация кроликов комплексом ДНК-ДНКаза I. Проведена иммунизация двух половозрелых кроликов (масса >3000 г) комплексом ДНК-ДНКаза-I по модифицированному методу [16]. Для получения контрольной сыворотки до иммунизации забирали кровь из краевой вены уха. Животным вводили 2 мл иммуногенной смеси, содержащей 0.75 мг/мл ДНК, 0.25 мг/мл ДНКазы I, 1 мл полного адъюванта Фрейнда. Инъекции производили подкожно по параверте-бральным линиям и за ухо. На шестой день введение повторяли, на 26-й день вводили половинную дозу иммуногенной смеси в неполном адъюванте Фрейнда. Забор крови осуществляли на 42-й день из бедренной артерии.
Исследование специфичности антисывороток.
Наличие антител к ДНК в сыворотках определяли методом ИФА. В качестве антигена использовали ДНК эритроцитов цыплят, положительного контроля - сыворотку больного системной красной волчанкой с высоким содержанием антител к нативной ДНК. Предварительно исследуемые образцы сывороток прогревали в течение 40 мин при 56°C для инактивации белков системы комплемента и диссоциации иммунных комплексов. Результаты оценивали с помощью планшетного спектрофотометра "Titertek Multiskan" ("Flow Laboratories", США).
Изготовление ДНК-сенсора. Стеклоуглерод-ный электрод (СУ-2500, НИИГрафит, Москва) с площадью рабочей поверхности 1.77 мм2 очищали механически и электрохимически кондиционированием при +800 мВ отн. Ag/AgCl в течение 3 мин в 0.2 М H2SO4. После этого в ячейку добавляли свежеперегнанный анилин до его объемной концентрации 0.074 М и сканировали потенциал в диапазоне от -300 до 800 мВ при скорости развертки 50 мВ/с (10 циклов). Электрод промывали дистиллированной водой и высушивали при ком-
натной температуре. После этого на рабочую поверхность наносили 2 мкл смеси, состоящей из 10 мкл 0.025 мг/мл ДНК и 2 мкл 3%-ного глутаро-вого альдегида, высушивали при комнатной температуре и промывали дистиллированной водой. ДНК-сенсор хранили при комнатной температуре, перед измерением кондиционировали в течение 20 мин в 0.001 М фосфатном буферном растворе, содержащем 0.03 М Na2SO4.
Измерение сигнала ДНК-сенсора. После кондиционирования в рабочем буферном растворе ДНК-сенсор промывали дистиллированной водой, высушивали при комнатной температуре и закрепляли в штативе рабочей поверхностью вверх. Наносили 5 мкл разбавленной сыворотки, накрывали пластиковой пробиркой Эппендорфа для предотвращения высыхания и оставляли на 10 мин. После этого электрод промывали рабочим буферным раствором, опускали в ячейку и регистрировали изменение потенциала во времени. Сигналом ДНК-сенсора служило изменение потенциала в минимуме, рассчитываемое по абсолютным значениям (метод миним
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.