научная статья по теме ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ДЕФИЦИТА ЭНДОГЕННЫХ КИНУРЕНИНОВ У МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ (APIS MELLIFERA L.) Биология

Текст научной статьи на тему «ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ДЕФИЦИТА ЭНДОГЕННЫХ КИНУРЕНИНОВ У МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ (APIS MELLIFERA L.)»

ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2010, том 60, № 2, с. 229-235

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПАТОЛОГИЯ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ

УДК 612.821.6 + 615.78

ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ДЕФИЦИТА ЭНДОГЕННЫХ КИНУРЕНИНОВ У МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ

(Apis mellifera L.)

© 2010 г. Н. Г. Лопатина, Т. Г. Зачепило, Е. Г. Чеснокова, Е. В. Савватеева-Попова

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, e-mail:lopatina@kolt.infran.ru Поступила в редакцию 09.02.2009 г. Принята в печать 26.10.2009 г.

Поведенческим и гистохимическим методами исследования показано значение эндогенных метаболитов триптофана — кинуренинов — в долговременном сохранении следа памяти и функционировании ключевых компонентов сигнального каскада (GluR — LIMK1 — F-актин), опосредующего формирование такового. Дефицит кинуренинов, вызванный инъекцией алло-пуринола (ингибитора триптофаноксигеназы) ингибирует долговременную память, снижает уровень экспрессии LIMK1 и парадоксально увеличивает содержание F-актина в головном ганглии пчелы. Эти данные согласуются с полученными нами ранее на дрозофиле фактами в условиях действия мутации структурного гена триптофаноксигеназы — vermilion.

Ключевые слова: кинуренины, долговременная память, LIMK1, F-актин, медоносная пчела.

Behavioral and Molecular Effects of Endogenic Kynurenines Deficit in the Honeybee (Apis mellifera L.)

N. G. Lopatina, T. G. Zachepilo, E. G. Chesnokova, E. V. Savvateeva-Popova

Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, e-mail: lopatina@kolt.infran.ru

The importance of tryptophan endogenous metabolites kynurenines in the long-term memory and functioning of the signal cascade GluR — LIMK1 — F-actin, mediating the long-term memory trace storage, was demonstrated. The deficit of kynurenines induced by allopurinol (tryptophanoxygenase inhibitor) suppressed the long-term memory, decreased the LIMK1 expression, and paradoxically increased the F-actin content in the honeybee brain. These data agree with the earlier findings in droso-phila mutant vermilion (the mutation of tryptophanoxygenase gene).

Key words: kynurenines, long-term memory, LIMK1, F-actin, honeybee.

Кинуренины — эндогенные метаболиты триптофана. Первые публикации о нейроак-тивности кинуренинов появились в печати в середине 60-х годов прошлого столетия [1]. К настоящему времени с полной уверенностью можно говорить о многофункциональной роли этих эндогенных соединений, в норме содержащихся в организме в наномолярных концентрациях [13]. Нарушения кинурени-нового пути обмена триптофана (КПОТ) наблюдаются в процессе таких грозных патологий человека, как эпилепсия, шизофрения, старческое слабоумие и других заболеваний, сопровождающихся нейродегенеративными

явлениями [7, 16, 19 и др.]. Наши исследования на модельных объектах — медоносной пчеле и дрозофиле, несущих мутации структурных генов ферментов, блокирующие последовательные этапы КПОТ и таким образом создающие либо дефицит, либо избыток кинуренинов в гемолимфе насекомых, — позволили сделать вывод о необходимости поддержания для нормального функционирования организма определенного баланса кинуре-нинов. Такой баланс определяет жизнеспособность, продолжительность жизни особей и темпов их старения, скорость созревания функциональных возможностей нервной си-

стемы в онтогенезе, нейронную активность в норме и при стрессе, характер сохранения в памяти индивидуально приобретаемого опыта [2]. По данным зарубежных авторов, одним из наиболее известных механизмов в нейроактивности кинуренинов является их взаимодействие с рецепторами глутамата и ацетилхолина [6], в чувствительности которых они также принимают участие [5, 14]. Полученные нами в последние годы на дрозофиле данные [2, 3] позволили впервые приблизиться к пониманию молекулярных механизмов в нейроактивности кинурени-нов. Данные свидетельствуют о зависимости экспрессии в головном ганглии насекомого белков — компонентов сигнального каскада (КЯ1- и NR2-субъединиц NMDA-рецептора, фермента лимкиназы1, фибриллярного актина) — от содержания в организме кинурениновых метаболитов триптофана, в первую очередь кинуреновой кислоты.

Лимкиназа 1 (ЫМК1) — эволюционно-консервативный нейронный нерецепторный фермент — является ключевым звеном сигнального каскада — рецепторы глутамата — малые ГТФазы (гуанозинтрифосфотазы) — ОМК1 — кофилин — Б-актин. Фосфорилируя по 8ег3 (серин 3) деполимеризующий актин-фактор кофилин (соШп), ЫМК1 ингибирует его активность и, таким образом, участвует в ремоделировании актинового цитоскелета нейронов, изменяя соотношение в содержании фибриллярного и глобулярного актина [12, 17, 18]. Известно, что молекулы актина являются важным компонентом цитоскелета и играют критическую роль в процессах движения и роста клеток [8—10]. В нервной системе от динамических изменений в структуре фибриллярного актина зависят организация пре-и постсинаптических зон, "заякоривание" рецепторов (в частности, глутаматных), размеры и форма шипиков дендритов. Последнее определяет эффективность нейронной трансмиссии, синаптическую пластичность, кратковременную и долговременную память, а также транскрипцию нейроспецифических генов. Ремоделирование актинового цито-скелета сопровождает различного рода патологии и нейропатологии, в частности нейро-дегенерацию [7].

Настоящая работа была предпринята с целью верификации выводов, сделанных на основании исследований на дрозофиле. В задачу входило изучение у медоносной пчелы особенностей формирования памяти и моле-

кулярных последствий дефицита эндогенных кинуренинов (содержания и локализации в головном ганглии LIMK1 и F-актина). В противоположность исследованиям на дрозофиле, где изменения в содержании кинуренинов достигали с помощью генетических методов (природных мутаций структурных генов, инактивирующих ферменты, необходимые для гидролиза КПОТ) у медоносной пчелы дефицит кинуренинов создавали искусственно фармакологическим путем — с помощью системных инъекций ингибитора триптофа-ноксигеназы аллопуринола.

МЕТОДИКА

Объектами исследования служили 10-су-точные медоносные пчелы краинской расы (Apis mellifera carnica Polm).

Инъекции аллопуринола. Пчелам вводили 0.15%-ный раствор аллопуринола в диметил-сульфоксиде (ДМСО). Инъекции делали в грудь, дорзально, обездвиженным охлаждением пчелам в объеме 2 мкл/особь. Контролем служили пчелы, которым вводили растворитель в том же объеме. Далее таких пчел с интервалом 2 ч использовали для оценки их способности удерживать в памяти выработанную условную реакцию, а их мозг подвергали иммуногистохимическому окрашиванию на LIMK1 и окрашиванию на F-актин фалло-идин-родамином. Ранее нами было показано, что нейрологический и поведенческий эффекты инъекций аллопуринола соответствовали по направленности действию мутации, вызывающей полное отсутствие кинуренинов у пчелы (мутация snow). Для оценки эффективности инъекций аллопуринола мы использовали поведенческий тест — способность пчел удерживать в кратковременной и долговременной памяти выработанную условную реакцию. По нашим данным, мутация snow способствует сохранению выработанного условного рефлекса в кратковременной, ин-гибируя долговременную память [4].

Все опыты (поведенческие и гистохимические) начинали через 2 ч после инъекций 0.15%-ного раствора аллопуринола и ДМСО.

Метод условных рефлексов. Подробный протокол эксперимента описан в работе [4]. Условный рефлекс вытягивания хоботка вырабатывали путем однократного сеанса обучения — сочетания индифферентного обонятельного стимула (запах гвоздики) с безуслов-

ным пищевым подкреплением (50%-ным раствором сахарозы). За 3 ч до эксперимента пчел лишали пищи и изолировали от семьи для достижения стабильного безусловно- и условнорефлекторного фонов. Использовали критерий — число пчел, удерживающих в памяти в течение 1 мин (кратковременная память) и 180 мин (долговременная память) по завершении процедуры обучения выработанную условную реакцию. До процедуры обучения оценивали сенсорную возбудимость (по числу пчел, ответивших спонтанной реакцией, — вытягиванием хоботка по направлению к еще неподкрепленному запаху) и пищевую возбудимость (по числу пчел, ответивших безусловнорефлекторной реакцией — вытягиванием хоботка в ответ на соприкосновение хеморецепторов передних конечностей с 50%-ным раствором сахарозы). Использовали установку, позволяющую вырабатывать и регистрировать условную реакцию одновременно у 18 фиксированных за крылья пчел. Число особей в каждой серии экспериментов колебалось от 54 до 90. Влияние инъекций ал-лопуринола (опыт) оценивали в процентах по отношению к контрольному уровню (инъекции растворителя ДМСО). Полученный экспериментальный материал обрабатывали статистически, используя парный критерий Вилкоксона.

Иммуногистохимия. Для выявления распределения LIMK1 использовали антитело к лимкиназе1 человека. Эти антитела были получены производителем "Santa Cruz Biotechnology" (США) к пептиду С-18 LIMK1 человека. Пептид С-18 картируется на С-конце лимкиназы1 человека (позиции 1—18). Для медоносной пчелы Apis mellifera (CG1848-PA, лимкиназа1, изоформа А) последовательность, гомологичная пептиду С-18, картируется в позициях 518—535. Выравнивание с помощью он-лайн программы BLAST показало высокое сходство последовательности пептида С-18 лимкиназы1 человека и последовательности CG1848-PA лимкиназы1 пчелы (показано рамкой), на основании чего было использовано данное антитело.

Насекомых подвергали холодовому наркозу и извлекали мозг из головной капсулы. Фиксацию в 4%-ном параформальдегиде проводили 3 ч. Обезвоживали препараты в спиртах (40%, 70%, 96%, 100%). Обезвоженные препараты помещали в метилбензоат, затем в метилбензоат/парафин (50 : 50). Инкубировали препараты в парафине в течение 3 ч, далее заливали в парафин. Из блоков готовили срезы толщиной 7 мкм. Срезы депара-финизировали (ксилол, спирты: 100%, 96%, 70%, 40%). Нагревали в цитратном буфере в СВЧ-печи при 950C. Препараты обрабатывали 30 мин в 0.3%-ной Н2О2. Инкубировали с блокировочной сывороткой (Vèctastain ABCelite KIT, Vector) 2 ч при 250С, затем с первичны

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком