МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ
УДК [57+61]::539.1.04:617.7:591.484.6:599.323.4/.7
ПОВРЕЖДЕНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ СЕТЧАТКИ ГЛАЗА У МЫШЕЙ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ И МЕТИЛНИТРОЗОМОЧЕВИНЫ
© 2014 г. Ю. В. Виноградова1*, В. А.Тронов1*2, К. Н. Ляхова1, В. А. Поплинская3, М. А. Островский1*4
Объединенный институт ядерных исследований, Дубна 2Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН, Москва 3Институт биологии развития им. К.Н. Кольцова РАН, Москва 4Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва
Сетчатка глаза состоит из терминально дифференцированных клеток, утративших способность к делению. Гибель этих клеток приводит к утрате зрения. Сетчатка мышей характеризуется сравнительно высокой устойчивостью к радиации. Эта устойчивость сетчатки обеспечивается ее способностью к восстановлению от повреждений, вызываемых факторами внешней среды. Цель работы заключалась в оценке повреждающего действия ионизирующего излучения и метилнитрозомоче-вины (МНМ) на структуру ДНК в сетчатке глаза мышей, функциональную активность сетчатки и в оценке ее способности к восстановлению in vivo. Результаты подтверждают способность зрелой сетчатки к структурному и функциональному восстановлению. Адаптирующее воздействие в малой дозе химического агента повышает устойчивость сетчатки к цитотоксической дозе этого генотокси-канта и препятствует дегенерации фоторецепторного слоя сетчатки. Полученные результаты указывают на возможность эффекта нейрогормезиса в сетчатке глаза мышей при действии ионизирующей радиации и химических веществ.
Сетчатка, у-кванты, ускоренные протоны, метилнитрозомочевина, повреждение ДНК, электрорети-нограмма, апоптоз, адаптивный ответ, нейрогормезис.
DOI: 10.7868/S0869803114040134
В 1990-х годах был описан дегенеративный процесс в сетчатке глаза у мышей и крыс, индуцированный введением в организм метилнитрозо-мочевины (МНМ) [1]. В основе ретинотоксиче-ского эффекта лежала апоптотическая гибель фоторецепторов. В последующие годы во многих работах МНМ использовали в качестве индуктора гибели фоторецепторов in situ [2]. МНМ — монофункциональный алкилирующий агент, модифицирующий основания в ДНК. В силу этого МНМ используется в качестве специфического ДНК-повреждающего агента — индуктора эксцизион-ных механизмов репарации ДНК [3], а в случае сетчатки глаза, дорепликативной репарации (BER, base excision repair) [4]. Что касается действия на сетчатку ионизирующей радиации, то, как было показано, зрелая сетчатка характеризуется высокой радиоустойчивостью [4—6]. Как ионизирующая радиация, так и МНМ способны индуцировать острую дегенерацию сетчатки гла-
* Адресат для корреспонденции: 141980 Дубна, Московская обл., ОИЯИ, ЛРБ; тел.: (49621) 6-48-42; факс: (49621) 6-5948; e-mail: vinojv@jinr.ru.
за, сочетающуюся с экспрессией проапоптотиче-ских белков PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), Bax (B cell lymphoma-2 associated X protein), AP-1 (activator protein complex-1) [7, 8]. Следует подчеркнуть, что индуцированная дегенерация сетчатки имеет высокий генотоксический порог, ниже которого признаки дегенерации не прослеживаются [7].
Целью нашей работы была оценка действия ионизирующей радиации и МНМ на функциональную активность сетчатки глаза — электроре-тинограмму (ЭРГ) и на способность ее к восстановлению после воздействия этих геноток-сикантов. Параллельно с регистрацией ЭРГ контролировали морфологические изменения клеточных слоев сетчатки и проводили TUNEL-детекцию гибели ее клеточных элементов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Животные. Исследования проводили на половозрелых мышах линии CBA х C57Bl (9), в возрасте 2.5 мес. Животных содержали в стандарт-
4
385
ных лабораторных условиях (22 ± 2°С, относительная влажность воздуха 60 ± 10% и 12-часовой световой период), при свободном доступе к воде и коммерческому корму. После регистрации ЭРГ применяли глазные капли левомецитина в качестве противомикробного лекарственного средства. Мышей умерщвляли в парах хлороформа и изымали глаза для морфологических и цитологических исследований сетчатки глаза.
Облучение. Мышей подвергали тотальному воздействию у-излучения 60Со в дозе 14 Гр (мощность поглощенной дозы 0.64 Гр/мин), на терапевтической установке "Рокус-М" в Объединенном институте ядерных исследований (г. Дубна), а также общему воздействию потока ускоренных протонов (с энергией частиц в пучке 150 МэВ/нуклон, ЛПЭ 10 кэВ/мкм, с мощностью дозы 1 Гр/мин) в дозе 14 Гр и локальному воздействию на область головы в дозе 25 Гр (в том же институте).
Введение метилнитрозомочевины. Кристаллическую МНМ ("Sigma", США) хранили при —20°С, растворяли в стерильном фосфатно-соле-вом буферном растворе (PBS) непосредственно перед введением внутрибрюшинно мышам в дозах 17, 35 и 70 мг/кг, в объеме не выше 0.7 мл. Контрольным животным вводили равный объем PBS. Через разное время (9 ч, 10 ч и 3—8 сут) после введения у живых мышей регистрировали ЭРГ и затем после умерщвления животных проводили морфологические исследования сетчатки глаза.
Морфологические исследования. Срезы сетчатки глаза 5 мкм окрашивали на предметном стекле смесью гематоксилин-эозин и микроскопирова-ли в проходящем свете. Морфометрические измерения поводили с помощью окулярной линейки.
Детекция гибели клеток. Для регистрации гибели клеток в микроскопических срезах сетчатки на предметном стекле использовали методику TUNEL, следуя указаниям прилагаемой инструкции к стандартному набору TUNEL (Trevigen, http: //www. trevigen. com/item/3/13/ 118/508/TACS_2_TdT_Fluorescein_Kit/). Визуализацию микроскопических изображений на срезах проводили на флуоресцентном микроскопе с набором фильтров для регистрациии флуоресценции флуоресцеинизотиоцианата (FITC), используя программу ImageJ.
Регистрация ЭРГ. Перед регистрацией ЭРГ мышей адаптировали к темноте (не менее 12 ч) и лишали корма на 24 ч. При тусклом свете мышей анестезировали внутримышечной инъекцией смеси золитил-ксилазин 1/1 в дозе 0.2 мл на 100 г веса животного. Для расширения зрачка в глаз за-
капывали 0.5%-ный раствор мидриацила. Электрод опускали на глазное яблоко, как контактную линзу; игольчатые электроды сравнения и заземления вводили под кожу около ушных раковин. ЭРГ записывали с помощью электрофизиологической системы "Нейрософт" при использовании программы Нейро-МВП.МЕТ. Стимуляцию ответа сетчатки осуществляли с помощью вспышек белого цвета длительностью 5 мс миниатюрного широкопольного фотостимулятора мини-ганцфельд-стимулятора (логарифм интенсивности варьировал от —3 до —0.5). ЭРГ характеризовали амплитудой, равной сумме а- и Ь-волн. Результат был представлен в виде среднего значения из трех последовательно снятых ЭРГ при значениях логарифма интенсивности вспышек —1.5, —1 и —0.5 с интервалом между ними 3 мин. При таком режиме регистрации в этом диапазоне зависимость амплитуды ЭРГ от интенсивности вспышки выходит на плато, что позволяет корректно проводить сравнение этого параметра.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Воздействие у-излучения и ускоренных протонов
в дозе 14 Гр не изменяет морфологию сетчатки и амплитуду ЭРГ
Как показали микроскопические исследования срезов сетчатки глаза, морфология клеточных слоев и сетчатки в целом в результате облучения у-квантами и ускоренными протонами в дозе 14 Гр не изменяется в течение всего времени жизни мышей (<7 сут). Это отражено на рис. 1, А. Здесь же представлены результаты морфометри-ческих измерений срезов сетчатки глаза, которые подтверждают отсутствие изменений (рис. 1, Б).
Для интактных и облученных в дозе 14 Гр животных определяли зависимость амплитуды ЭРГ от интенсивности возбуждающей вспышки с интервалом между вспышками 5 мин (рис. 2, Б). Как видно, и для контрольных, и для облученных животных зависимость выходит на плато в области интенсивностей от — 1.5 до —0.5 лог. ед. Это делает правомочным усреднение амплитуды ЭРГ в этом диапазоне интенсивностей. Найденные таким образом средние значения амплитуды ЭРГ отражены в гистограмме (рис. 2, В). Из гистограммы следует, что достоверные различия между контрольными и облученными животными отсутствуют (рис. 2, В). Таким образом, можно заключить, что воздействие у-квантов и ускоренных протонов в дозе 14 Гр не вызывает структурных изменений и функциональных нарушений сетчатки глаза у мышей, что иллюстрируется рис. 2, А.
А
Б
Рис. 1. Спустя 3—5 сут после тотального облучения животных у-квантами (у) или ускоренными протонами (р) в дозе 14 Гр в сетчатке глаза мышей не обнаружено морфологических изменений по сравнению с контролем .
Облучение ускоренными протонами в дозе 25 Гр вызывает гибель клеток-фоторецепторов и снижает амплитуду ЭРГ
Протоны в радиационной дозе, увеличенной до 25 Гр, вызывают заметную морфологическую деструкцию сетчатки глаза спустя 3 сут после воздействия (рис. 3, А, В). Как показывает TUNEL-тестирование, этот процесс сопровождается массовой гибелью клеток-фоторецепторов (рис. 3, Б, Г). Строго говоря, на основании только результатов TUNEL нельзя сделать вывод о преобладающем механизме клеточной гибели (апоптоз—некроз), поскольку в основе метода лежит реакция терминальной нуклеотидил трансферазы, маркирующей возникновение разрывов ДНК. Тем не менее, мы не исключаем участие в гибели клеток-фоторецепторов механизма апоптоза после воздействия протонов, что подтверждается наличием в ядерном слое клеток-фоторецепторов с характерными для апоптоза фрагментированными клеточными ядрами и с ядрами, содержащими конденсированный хроматин (рис. 3, Д).
K
A
Y/P
40 мкВ
Б
240
кВ 200
$ 160
д
ту
и л п
120
80
40
-1.0 -0.5
9 ч 15 ч 20 ч
Log интенсивности, сд/м2
Рис. 2. Функциональная активность сетчатки глаза в ответ на облучение у-квантами и протонами в дозе 14 Гр. А — профиль электроретинограммы глаза (ЭРГ) у мышей после тотального облучения в дозе 14 Гр; Б — зависимость амплитуды от интенсивности вспышки: 1 — контроль, 2 — спустя 15 ч после облучения, 3 — спустя 20 ч после облучения; В — гистограмма амплитуд в максимуме после тотального облучения животных в дозе 14 Гр.
Рис. 3. Дегенерация сетчатки глаза у мышей после локального воздействия
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.