МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 3, с. 405-416
= МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА =
УДК 597.963.576.11
ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК КАК ПОКАЗАТЕЛЬ УРОВНЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗОЛЯЦИИ ГЕНОМОВ РЫБ
© 2015 г. Е. А. Шубина1, 2*, Е. В. Пономарева2, А. В. Климов3, А. В. Климова4, О. С. Кедрова2
Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 2Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119192 3Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии, Петропавловск-Камчатский, 683000 4Камчатский государственный технический университет, Петропавловск-Камчатский, 683003
Поступила в редакцию 12.01.2015 г.
Принята к печати 17.01.2015 г.
Несмотря на то, что функциональная роль большинства типов не кодирующих белки ядерных повторяющихся последовательностей до сих пор не выяснена, использование некоторых из них в качестве маркеров филогении и таксономии оказалось адекватным при изучении генетического родства организмов на видовом и внутривидовом уровня. В нашей работе использованы несколько типов маркеров такого рода. Во-первых, при помощи микросателлитных маркеров исследовали популяции морских и проходных рыб с различной степенью генетической подразделенности, а именно — чилийской ставриды (Trachurus murphyi), нескольких Западно-и Восточно-Беринговоморских популяций минтая (Theragra halcogramma), популяций проходной атлантической форели (Salmo trutta), а также изолированных и проходных популяций гольцов. Во всех случаях уровень полиморфизма локусов пропорционален уровню потока генов между популяциями. Во-вторых, при помощи сателлитной ДНК исследовали филогенетические отношения внутри родов лососевых рыб Salmo, Оncorhynchus, Salvelinus и Coregonus. Соотношения показателей генетических дистанций хорошо совпадают с таксономическими соотношениями, установленными на основе морфологических признаков и различных других биохимических маркеров, и коррелируют с эволюционным возрастом групп по другим показателям. В-третьих, использовали метод PCR-RAPD (с набором пар 20-членных праймеров) для изучения сигов (род Coregonus), проходных и изолированных популяций и видов гольцов (род Salvelinus). По результатам построены филогенетические деревья, способствующие разрешению спорных вопросов систематики этих групп. Сравнение некоторых последовательностей, выявляемых методом RAPD, показало, что в них содержатся консервативные фрагменты кодирующих последовательностей, а также полиморфные повторяющиеся последовательности (минисателлиты), относящиеся или к межгенным участкам, или к интронам. Эти результаты свидетельствуют о неслучайном характере дивергенции повторяющейся ДНК, что может отражать эволюцию исследованных групп рыб. Высказывается предположение, что сателлитные повторы гетехроматина участвуют в создании репродуктивного барьера.
Ключевые слова: тандемная поторяющаяся ДНК, микросателлитный и мультилокусный анализ, рыбы, генетическая изоляция, видообразование.
REPEATED DNA SEQUENCES AS INDICATOR OF THE LEVEL OF FISHES GENOME ISOLATION, by E. A. Shubina1,2*, E. V. Ponomareva2, A. V. Klimov3, A. V. Klimova4, O. S. Kedrova2 (1Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Moscow State University, Moscow, 119992 Russia, *e-mail: shubina@ genebee.msu.su; 2Biology Department, Moscow State University, Moscow, 119992 Russia; 3Kamchatka Federal Research Institute of Fisheries and Oceanography, Petropavlovsk-Kamchatskiy, 683000 Russia; 4Kamchatka State Technical University, Petropavlovsk-Kamchatskiy, 683003 Russia). Though the still uncertain function the majority of noncoding nuclear repeated sequences types, many of them were found to be most adequate for organisms of species and intraspeces taxonomic level researches. By help of microsatellite markers the populations of sea and anadromous fishes with different level of genetic structuring were studied: jack mackerel Trachurus murphyi, some West Bering Sea and East Bering Sea pollock populations, populations of anadromous Atlantic trout Salmo trutta and Fare East anadromous and freshwater char populations. Always the genotype patterns were clearly representative of gene flow between populations compared. With satellite DNA the phylogenetic relations in salmon fishes genera Salmo, Оncorhynchus, Salvelinus and Coregonus were researched. The genetic distances resulted corresponded to phylogenies established earlier on the base of morphological and different biochemical markers and were in good agreement with dating of the clades. The 20-mer primer system was used in PCR-RAPD studies of white fish species (g. Coregonus) and anadromous and isolated
* Эл. почта: shubina@genebee.msu.su
freshwater populations and species of char (g. Salvelinus). The phylogenetic trees were constructed and permit to resolve the disputable problems of these groups systematic. Sequencing of PCR-RAPD products revealed occurrence in them of conservative areas of coding sequence and polymorphic repeated sequences (minisatellites) at intergenic and intron areas. The results obtained argue nonrandom nature of repeated DNA divergence that is representative of evolution of the studied fishes. The heterochromatin participation in reproductive barrier origin is supposed.
Keywords: tandem repeated DNA, microsatellite and multilocus analysis, fishes, genetic isolation, speciation. DOI: 10.7868/S0026898415030155
Исследование полиморфизма ДНК, особенно бурно развивающееся в последние десятилетия, наряду с получением множества геномных данных по ключевым видам и таксонам эволюционного древа, тем не менее, не привело к решению фундаментальной научной проблемы биологии — проблемы вида и видообразования. Противоречие связано с дискретностью нового вида как генетически независимо эволюционирующей группы организмов и непрерывностью процесса эволюции. В свете биологической концепции процесс видообразования у организмов с половым способом размножения заключается в накоплении различий, достаточных для возникновения барьера частичной или полной репродуктивной изоляции. Это, в свою очередь, подразумевает процесс неограниченных генетических рекомбинаций внутри вида и прекращение потока генов между видами [1, 2]. В то же время для симпатри-ческих, обитающих совместно популяций, возможность перекрестного скрещивания перманентна, и даже слабого обмена генами достаточно, чтобы возникновение видов оказалось невозможным. Таким образом, симпатрическому видообразованию должно предшествовать внезапное формирование и быстрое распространение репродуктивного барьера между популяциями.
Цель настоящего исследования — проследить связь между изменениями во фракции повторов и степенью генетической изоляции рыб. Мы также предполагаем показать на нескольких модельных объектах, что накопление и фиксация мутаций в некодирующей и нефункциональной ДНК строго следует филогенетическим построениям исследованных групп, сделанным на основе морфологических признаков и кодируюших последовательностей.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве моделей использованы морские, пресноводные и проходные рыбы. Коллекции материала предоставлены сотрудниками кафедры ихтиологии МГУ, Института Общей генетики РАН и Всероссийского Научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО). ДНК выделяли из заспиртованных тканей (печени, молок, жиро-
вых плавников) по методу Arrighi и соавт. [3] или с использованием Silica-метода (наборы "Nu-cleoSpin", Masherey-Nagel, Германия, и "Diatom™ DNA Prep 100", "ИзоГен", Россия). Для исследования популяционно-генетической структуры кумжи (Salmo trutta), обитающей в реках бассейна Белого моря, ДНК выделяли из чешуи [4]). Подробные описания выборок и методов анализа можно найти в ранее опубликованных работах [4—8].
Для исследования дивергенции повторяющихся последовательностей подобраны ДНК-маркеры с различной скоростью эволюции, соответствующей таксономическому уровню рассматриваемой модели. Схема микросателлитного анализа популяционной структуры чилийской ставриды (T. murphyi) была основана на литературных данных [9]; генотипирование по микросателлитам проводили в 8% ПААГ. Анализ популяционной структуры минтая Берингова моря, Theragra hal-cogramma, описан ранее [8].
Сателлитную ДНК исследовали при помощи модифицированного метода рестриктазного анализа. Во фрагменты — продукты обработки рестрик-ционными эндонуклеазами — вводили концевую радиоизотопную метку, что резко повышает разрешающую способность метода ("таксонопринт") [10]. Продукты гидролиза разделяли путем электрофореза в 6%-ном полиакриламидном геле (20 х 40 см2) с последующей авторадиографией.
Оптимальные для исследования случайные праймеры для мультилокусного PCR-RAPD анализа (20 п.н.) отбирали с учетом вариабельности и воспроизводимости реакций амплификации и электрофореза (в 1.5—2% геле агарозы) каждого из них.
Поскольку все виды опытов представляют те или иные модификации фрагментного анализа, для филогенетических оценок использовали величины генетических дистанций Nei [11], выявляемые в программе для построения деревьев TreeConw1.3 [12] с использованием бутстреп-ана-лиза.
Для последующего секвенирования нуклеотид-ных последовательностей продуктов PCR-RAPD, фрагменты клонировали в E. coli при помощи набора реактивов InsTAclone™ PCR Cloning Kit ("Fermentas", Литва). Для поиска гомологичных после-
Рис. 1. Примеры электрофоретических профилей микросателлитных локусов морских и проходных рыб. M — маркер длин фрагментов, "20 bp Ladder" ("BioRad", США). а — Локус Gsp08 чилийской ставриды, Trachurusmurphy; б — локус Tch14 минтая Theragra chalcogramma; в — локус SSA197 кумжи Salmo trutta.
довательностей в базах данных NCBI использовали программы BLAST и BLASTN [13, 14].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Микросателлитная ДНК
Мы исследовали три группы рыб популяцион-ного уровня; условно, все три можно отнести к морским (хотя лососи, как мы знаем, проходная рыба), но с разной степенью изоляции. Вначале провели
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.