ГЕНЕТИКА, 2012, том 48, № 5, с. 599-607
= МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 575:599.9
ПОВЫШЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА NETO2 КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МАРКЕР ПРИ РАКЕ ПОЧКИ И ЛЕГКОГО
© 2012 г. Н. Ю. Опарина1*, А. Ф. Садритдинова1*, А. В. Снежкина1*, А. А. Дмитриев1, Г. С. Краснов1, В. Н. Сенченко1, Н. В. Мельникова1, М. С. Беленикин1, В. А. Лакунина1, 2, В. А. Веселовский2, О. А. Степанов1, 3, А. В. Кудрявцева1
1 Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва 119991 e-mail: rhizamoeba@mail.ru
2Московский государственный университет им. Ломоносова, кафедра молекулярной биологии, Москва 119991 3 Московский физико-технический институт (государственный университет), Моск. обл., Долгопрудный 141700
Поступила в редакцию 08.06.2011 г. Окончательный вариант получен 15.12.2011 г.
Злокачественные заболевания сопровождаются изменениями в геноме, транскриптоме и протеоме опухолевых клеток. Изучение молекулярных маркеров на основе ДНК, мРНК или белков — основной путь для ранней высокоспецифичной диагностики опухолей. В настоящее время не выявлено "универсальных" онкомаркеров, однако для некоторых генов наблюдаются сходные тенденции в изменении экспрессии в определенных типах эпителиальных опухолей. С помощью биоинформа-тического скрининга транскриптомных баз данных идентифицирован потенциальный перспективный маркер почечно-клеточной карциномы — ген NETO2. Методом ПЦР в режиме реального времени показано значительное повышение уровня мРНК гена NETO2 в 90% образцов светлоклеточ-ного рака почки, а также в 70% образцов плоскоклеточного рака легкого и 50% папиллярного рака почки. В меньшей степени была увеличена экспрессия NETO2 при раке шейки матки и раке толстой кишки, в то время как при раке желудка выявлена тенденция к снижению экспрессии этого гена. Таким образом, ген NETO2, кодирующий мембранный гликопротеин с малоизученной функцией, может быть предложен в качестве нового перспективного маркера для диагностики рака почки и плоскоклеточного рака легкого.
Ранняя диагностика злокачественных заболеваний — залог успеха применяемой терапии. Поэтому крайне актуальным для современной биомедицины является поиск чувствительных молекулярных маркеров онкологических заболеваний. Многоэтапный процесс злокачественной трансформации и последующей прогрессии заболевания сопровождается существенными изменениями генома (делеции, амплификации, перестройки, мутации), транскриптома (изменение уровня экспрессии генов и сплайсинга) и протеома (изменение концентрации белков и их пост-трансляционной модификации). Помимо этого происходят значительные изменения на эпигенетическом уровне, такие как метилирование и деметилирова-ние специфических геномных локусов. Многочисленность таких изменений усложняет поиск среди них диагностически перспективных маркеров. Изменения транскриптома при канцерогенезе относятся к наиболее широко изучаемым, по ним накоплен значительный объем эксперимен-
* Авторы внесли равный вклад.
тальных сведений, доступных для анализа в различных базах данных. Как правило, сравнительный анализ транскриптомов в норме и опухоли выполняют, используя данные секвенирования кДНК (база данных dbEST и современные данные высокопроизводительного секвенирования RNAseq) и проводя скрининг опухолевых образцов при помощи гибридизации кДНК на микропанелях. Отметим, что большинство выявленных с помощью этих подходов потенциально диагностически ценных признаков требуют подтверждения с помощью точного количественного метода ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Центральной проблемой онкоурологии является рак почки, основными гистологическими подтипами которого являются светлоклеточный (более 80%) и папиллярный (10—15%) рак [1, 2]. Нами был проведен комплексный биоинформа-тический анализ двух типов транскриптомных данных, доступных для рака почки: нуклеотид-ных последовательностей EST и гибридизации кДНК на микропанелях. Это позволило выявить новый потенциальный молекулярный маркер ра-
ка почки — ген NETO2. Этот ген кодирует малоизученный мембранный белок, относящийся наряду со своим единственным паралогом NETO1 к уникальному подсемейству CUB- и LDLa-содер-жащих белков [3]. Было показано участие белков NETO1 и 2 в нейрон-специфичных процессах, в частности — в образовании регуляторного комплекса с рецепторами каинатного типа [4]. Нами впервые показана вовлеченность NETO2 в канцерогенез, а также его экспрессия на уровне мРНК в эпителиальных тканях. Эти результаты коррелируют с данными ProteinAtlas. Методом ПЦР-РВ изучено изменение уровня мРНК гена NETO2 в образцах светлоклеточного и папиллярного рака почки, а также других эпителиальных опухолей — плоскоклеточного рака легкого, рака толстой кишки и рака желудка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Анализ транскриптомных баз данных. Анализ коротких экспрессирующихся нуклеотидных последовательностей (EST) нормальных и опухолевых тканей базы dbEST [5] проведен с помощью разработанной нами программы "CompEST" и сервиса Genehub Gepis [6]. Использовали EST из клонотек NCBI [5], полученных из нормальных клеток почки человека и соответствующих злокачественных опухолей, при этом использовали как данные недостаточно полной аннотации (описанные как "kidney cancer"), так и клонотеки с большим набором метаданных. Из 16 наиболее представительных клонотек (>1000 EST в клоно-теке) рака почки 5 относились к редко встречающейся опухоли Вилмса, поэтому эти клонотеки были исключены из сравнительного анализа.
Нами проведен дополнительный отбор клоно-тек EST с помощью поиска в базе данных dbEST по ключевым словам "kidney", "renal" (при дополнительном фильтре — использование только клонотек из тканей и клеток человека), при этом были отобраны только те клонотеки, которые отвечают следующим критериям: представительность клонотеки должна превышать 600 EST, среди нуклеотидных последовательностей EST должны присутствовать не менее 2 EST, соответствующих по крайней мере одному из генов ACTB, GUSB, TBP, RPN1, PPIA. Эти гены рекомендованы для экспериментального нормирования данных по экспрессии генов при исследовании рака почки [7, 8]. Проведено двухэтапное исследование, при котором сначала выявляли спектр мРНК с предположительно повышенной экспрессией, затем полученные результаты сравнивали с данными гибридизации кДНК на микропанелях. После предварительного нормирования на EST, соответствующих набору контрольных ге-
нов, с помощью программы CompEST был составлен рейтинг генов согласно степени, частоте и достоверности повышения их уровня экспрессии в препаратах рака почки. При этом были исключены EST, не содержащие экзон-экзонных границ (поскольку они могут представлять собой продукты загрязнения препарата примесью геномной ДНК), а также EST со значительными отклонениями в нуклеотидной последовательности от известных мРНК аннотированных белок-ко-дирующих генов человека (содержащие >15% замен по сравнению с известными мРНК, отличающиеся от них по экзон-экзонным границам, а также EST, содержащие известные геномные повторяющиеся элементы). Такой подход позволил выявить гены, уровень трансляционно активных мРНК которых наиболее достоверно повышен при раке почки, что потенциально позволяет определять как мРНК-, так и белковые маркеры.
Отобранные нуклеотидные последовательно -сти EST для каждого типа ткани человека были разбиты на две группы — соответствующие нормальной и опухолевой ткани. Из рассмотрения были исключены EST, полученные из смешанных тканевых препаратов и из клеточных линий. Соотнесение набора EST с соответствующими генами человека проводили согласно геномному выравниванию EST по данным базы UCSC ([9], версия hg19).
Поскольку данные клонотек EST не всегда содержат достаточно описаний, было применено дополнительное исследование уровня экспрессии отобранных генов — потенциальных опухолевых маркеров — с использованием данных гибридизации кДНК на микропанелях базы ONCOMINE [10]. Для каждого из генов были определены уровень экспресии и его изменение в наборе образцов светлоклеточного рака почки и папиллярного рака почки.
Образцы тканей. Образцы тканей плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы легкого (I—III стадий), светлоклеточной почечноклеточ-ной карциномы (I—IV стадий), рака толстой кишки (I—III стадий), рака желудка (I—III стадий), рака шейки матки (I—III стадий) и прилегающие к опухолям морфологически нормальные ткани (т.н. "условные нормы") собраны и затем охарактеризованы в НИИ Российского онкоцентра им. Н.Н. Блохина РАМН. Клинический диагноз подтвержден патоморфологическим исследованием в отделении патологической анатомии опухолей человека РОНЦ РАМН. В исследовании использовали по 10 образцов каждого гистологического типа рака.
Выделение РНК из тканей, получение кДНК. Суммарную РНК выделяли из замороженных, измельченных в жидком азоте образцов нормаль-
ных и опухолевых тканей с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit ("Qiagen"). Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop® ND-1000 ("NanoDrop Technologies Inc.", США). Качество выделенной РНК проверяли электрофорезом в 1%-ной агарозе в присутствии бромистого этидия и по значению отношения 260/280 нм, которое составляло 1.8 — 2.0.
Для всех образцов РНК получали одноцепо-чечную кДНК, в реакцию добавляли по 1 мкг суммарной РНК, предварительно обработанной ДНКазой I ("Fermentas"), гексануклеотидные праймеры и обратную транскриптазу M-MuLV ("Fermentas"). Реакцию проводили в следующем температурном режиме: 25°С — 10 мин, 42°С - 60 мин, 50°С - 10 мин, 70°С - 10 мин.
Контрольные гены для нормирования данных ПЦР-РВ. Для оценки уровня мРНК гена NETO2 в образцах рака легкого, шейки матки и толстой кишки в качестве контрольного выбран ген GAPDH как наиболее подходящий для тканей легкого и толстой кишки согласно данным литературы [11] и оценкам, проведенным в работе. Нормирование данных для рака почки проводили относительно гена RPN1, для рака желудка — относительно гена B2M. Уровень мРНК генов GAPDH, RPN1 и B2Mв реакции изменялся в опухолях по сравнению с нормой в среднем не более 2 раз (P < <
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.