БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 3, с. 327-335
УДК 577.113.7
ПОВЫШЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ КОНЪЮГАТОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
С НАНОЧАСТИЦАМИ ЗОЛОТА
© 2015 г. Р. Р. Гарафутдинов#, *, А. Р. Сахабутдинова*, А. В. Чемерис*
*ФГБУНИнститут биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054, г. Уфа, просп. Октября, 71
Поступила в редакцию 24.09.14 г. Принята к печати 10.12.14 г.
В последнее время активно ведется разработка реагентов на основе модифицированных олигонук-леотидов и коллоидного золота для обнаружения специфичных фрагментов нуклеиновых кислот. Такие реагенты представляют собой конъюгаты, стабилизированные связями между тиольной группой олигонуклеотидной молекулы и атомами золота в наночастице. Прочность связывания олиго-нуклеотидов с золотыми наночастицами напрямую влияет на стабильность конъюгатов и возможность дальнейших манипуляций с ними. В данной работе предложен способ повышения прочности закрепления олигонуклеотидов на поверхности наночастиц золота путем использования якорных групп различной структуры, состоящих из нескольких дитиолановых остатков. Проведено сравнительное исследование влияния структуры связующего звена между фрагментом ДНК и наночасти-цей на стабильность конъюгатов при воздействиях, типичных для манипуляций с олигонуклеотид-ными зондами.
Ключевые слова: олигонуклеотиды, наночастицы золота, конъюгаты, якорные группы, дитиолановый фрагмент.
DOI: 10.7868/S0132342315030033
ВВЕДЕНИЕ
Значительный интерес с точки зрения создания новых биоаналитических систем вызывают конъюгаты олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН) и на-ночастиц золота (НЧЗ). Они находят все большее применение как для обнаружения низкомолекулярных аналитов, так и для выявления биомакромолекул — белков и нуклеиновых кислот [1—4]. Наиболее интригующей является возможность их использования в медицине для диагностики различных заболеваний путем анализа специфических биомаркеров и типов клеток [5—7]. Очевидно, что для успешного функционирования подобные наноструктуры должны отвечать определенным требованиям, среди которых ключевым является стабильность, т.к. она критическим образом влияет на функционирование всей аналитической системы. В связи с этим вопросам повышения стойкости конъюгатов уделяется большое внимание.
Сокращения: ОДН — олигодезоксирибонуклеотид/ олигонуклеотид; НЧЗ — наночастицы золота; FAM — 5'-карбоксифлуоресцеин; DTPA — амидофосфит дитиола (1,2-дитиан-4-0-диметокситритил-5-[(2-цианоэтил-Лг,Лг-диизопропил)]амидофосфит); BSPP — дигидрат дикалийной соли бис(я-сульфонатофенил)фенилфосфина. #Автор для связи (тел./факс: +7 (347) 235-60-88; эл. почта: garafutdinovr@gmail.com).
В настоящее время общепринятым способом закрепления ОДН на поверхности НЧЗ является образование связи "сера—золото". Одинарная связь Au—S в масштабе такой крупной молекулярной конструкции как конъюгат ОДН и НЧЗ является относительно непрочной, поэтому под воздействием различных физических факторов может происходить ее разрыв [8—10]. Устойчивость конъюгатов к световому облучению непосредственно влияет на ряд их важных характеристик, например, на терапевтический потенциал [11]. Реакции с участием конъюгатов протекают преимущественно в водно-солевых и/или водно-органических растворах, поэтому химические факторы (pH, ионная сила и др.) также оказывают влияние на их устойчивость [12]. С точки зрения разработки новых приложений для проведения ферментативных реакций с участием конъюгатов in vitro не менее важной является их термическая стабильность [13].
Для повышения прочности связывания используют два пути: 1) образование нескольких связей Au—S в расчете на одну молекулу ОДН, 2) применение дополнительных компонентов реакционных смесей или варьирование структуры олигонуклеотидов. Так, предложен ряд специальных тиолсодержащих реагентов, позволяющих закреплять молекулы ОДН на золотых поверхно-
стях [14—16]. Для еще более прочного связывания разработаны дендримерные структуры, образующие мультитиольные якорные групп [17, 18]. Такие структуры дают очень прочные конъюгаты, однако за счет стерических затруднений они уменьшают количество молекул ОДН, способных иммобилизоваться на одну наночастицу. Описаны оригинальные подходы, в которых стабилизация конъюгатов достигается не увеличением количества меркаптогрупп в расчете на одну молекулу ОДН, а с помощью других приемов [19—21]. С точки зрения удобства автоматизированного синтеза ОДН и стехиометрии их взаимодействия с НЧЗ более удачным представляется использование ами-дофосфитных реагентов, позволяющих вводить в молекулы ОДН дисульфидные остатки [22, 23]. Ли с сотр. провели сравнительное изучение термической стабильности нескольких типов конъюгатов на основе подобного реагента [24]. Несомненно, что во всех случаях необходимо также учитывать особенности исходных НЧЗ, в частности, способы их получения и стабилизации коллоида [25, 26].
Целью данной работы стал поиск простого приема стабилизации конъюгатов ОДН с НЧЗ, основанного на стандартном способе образования связи Au—S, путем конструирования новых типов молекулярных якорных групп с использованием модифицирующего реагента, генерирующего циклические дисульфидные (дитиолановые) фрагменты в молекулах ОДН.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Иммобилизация ОДН на поверхности золота с образованием связи Au—S является наиболее оптимальной и останется, по всей видимости, единственно используемой в обозримом будущем. Альтернативы подобной конъюгации не предвидится в силу простоты получения как тиолмоди-фицированных ОДН, так и удобства их взаимодействия с золотом. Однако единичная связь Au—S не обеспечивает достаточно прочного прикрепления крупных молекул ОДН к поверхности золота, поэтому продолжают предприниматься попытки повышения прочности такого прикрепления. Удобный способ связывания обеспечивают циклические дисульфидные (дитиолановые) якорные группы, описанные в ряде работ [14, 15, 22, 27]. В настоящее время коммерчески доступны реагенты, позволяющие синтезировать рутинным амидо-фосфитным методом ОДН, содержащие дитиолановые остатки в любом количестве и в любом заданном положении цепи, что позволяет конструировать олигонуклеотиды необходимой структуры.
Нами с использованием амидофосфита дитио-ла (DTPA) были синтезированы олигонуклео-тидные зонды Рг1—Рг4 (рис. 1). Они содержат на 5'-конце различающиеся между собой якорные фрагменты, а на З'-конце — флуорофор FAM
(^фл ~ 520 нм). Еще в начале 2000-х было показано, что НЧЗ могут выступать активными тушителями флуоресценции в конъюгатах с флуоресцентно меченными ОДН [28, 29], а позже был изучен и механизм такого тушения [30—33]. На основе данного явления разработано множество подходов и практических приложений [4, 34, 35]. По возрастанию флуоресценции при отщеплении олигонуклеотидного зонда можно судить о его количестве и прочности иммобилизации на золотой наночастице. Зонды Рг1-Рг4 содержат в якорном фрагменте тиокомпонент, тимидин-5'-моно-фосфат (рйТ) и полиэтиленгликольные линкеры. Согласно рекомендации производителя DTPA, при получении олигонуклеотидов с последовательно расположенными дитиолановыми фрагментами необходимо перемежать их вставками, например, рёТ с целью снятия стерических затруднений в ходе синтеза. Данная рекомендация была нами принята во внимание, поскольку в структуре зонда Рг3 имеется последовательность из трех дитиолановых остатков. Однако и для остальных зондов также осуществляли введение рёТ в паре с S2 с целью обеспечения сравнимой молекулярной структуры якорных групп. Полиэти-ленгликольный спейсер отдаляет нуклеотидную последовательность от поверхности наночастицы, а также способствуют более полной загрузке, как было ранее показано [36]. Якорные группы обеспечивают разное количество точек связывания (одинарных связей Au—S): для Рг1 — одна точка в расчете на одну молекулу ОДН, для Рг2 — две точки, для Рг3 и Рг4 — по 6 точек теоретически. Якорная группа зонда Рг3 имеет систему последовательно расположенных дисульфидных групп, он "садится" на наночастицу линейно. В зонде Рг4 дисульфидные группы располагаются зонтиком. В этом случае прикрепление обеспечивается по типу "треноги".
Зонды Рг1—Рг4 были введены во взаимодействие с НЧЗ, полученными согласно работе [37]. По данному методу генерация НЧЗ осуществляется легко разлагающимся восстановителем — боргидридом натрия, а стабилизация достигается за счет цитрат-иона. Был использован протокол, рассчитанный на синтез наночастиц размером 5— 10 нм. Анализ электронного спектра раствора НЧЗ показал наличие полосы поглощения с максимумом при 515 нм, что свидетельствует об образовании частиц целевого размера. Дальнейшее взаимодействие НЧЗ и олигонуклеотидных зондов проводили из расчета, что на одну наночасти-цу размером 10 нм может иммобилизоваться теоретически до 102 молекул ОДН [36, 38, 39]. При взаимодействии брали разные молярные соотношения наночастиц и зондов исходя из их измеренных концентраций и с учетом максимально возможной степени загрузки поверхности — 1 : 1 (образцы серии 1), 1 : 2 (образцы серии 2) и 1 : 5 (образцы серии 3) соответственно. Избыток ОДН
Общая структура зондов
5'-HKopb-d(N)20-FAM-3'
Якорные группы HS-pdT-X1~ S2-pdT-X1~ S2-pdT-S2-pdT-S2-pdT-X1~
Зонды Pr1 Pr2 Pr3
Схемы прикрепления НЧЗ НЧЗ
Конъюгаты MS DS CDS
Серии MS1, MS2, MS3 DS1, DS2, DS3 CDS1, CDS2, CDS3
(S2-pdT)3 -X2-X1~
Pr4
viT
НЧЗ
TDS
TDS1, TDS2, TDS3
В якорных группах
HS — меркаптогруппа
pdT — тимидин-5'-монофосфат
S2 — дитиолановый фрагмент — O O—
S-S
X1 — линейный линкер (—OCH2CH2—)6
X2 - разветвленный линкер (OCH2CH2CH2OCH2)3CCH-
Рис. 1. Структура олигонуклеотидных зондов и конъюгатов на их основе.
брался для того, чтобы гарантировать полное заполнение поверхности. Таким образом были получены по три серии конъюгатов: MS1, MS2 и MS3 содержали меркаптогруппу, DS1, DS2 и DS3 — единичный дитиолановый фрагмент, CDS1, CDS2 и CDS3 — якорную группу с тремя линейно расположенными дитиолановыми остатками, TDS1, TDS2 и TDS3 — якорную группу с тремя дитиолановыми фрагментами, расположенными по концам линкера Х2 (рис. 1).
В ходе очистки конъюгатов пу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.