МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 6, с. 1030-1039
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21
Ускоренная публикация
ПОЗИЦИОНИРОВАНИЕ НУКЛЕОСОМ НА РЕПРЕССИРОВАННОМ И АКТИВНОМ ГЕНЕ НЕОМИЦИНФОСФОТРАНСФЕРАЗЫ (NPTII) В СОСТАВЕ ДРОЖЖЕВОЙ ПЛАЗМИДЫ
© 2008 г. Г. И. Кирьянов1*, Л. В. Исаева1, Л. Н. Кинцурашвили2, М. Г. Захарова3
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 2Центр сельскохозяйственной биотехнологии Министерства образования и науки Республики Грузия,
Тбилиси, 380062 Грузия 3Сертификационный Центр "ПРОДЭКС", Москва, 119992 Поступила в редакцию и принята к печати 10.06.2008 г.
Сконструирована дрожжевая плазмида, содержащая гибридный промотор GAL-CYC, ген NPTII, кодирующий неомицинфосфотрансферазу, и расположенную между ними последовательность FRT. В GAL-CYC промоторе находятся четыре UAS-последовательности и два сближенных ТАТА-бокса в CYC-части [1]. При индукции несущих эту конструкцию клеток дрожжей галактозой ген NPTII эффективно экспрессируется, что обеспечивает устойчивость клеток к антибиотику G418. Изучали позиционирование нуклеосом на репрессированном и индуцированном гене NPTII в трансформированных клетках. В репрессированном состоянии (рост на глюкозе) отчетливо видно позиционирование трех нуклеосом. На CYC-части промотора локализованы две нуклеосомы, причем одна из них захватывает оба ТАТА-бокса; третья нуклеосома перекрывает FRT-последовательность и начало структурной части гена. Все три нуклеосомы позиционированы поливариантно, что предполагает возможность их скольжения вдоль ДНК. При активации экспрессии гена NPTII галактозой наблюдается скольжение двух нуклеосом по промотору, вследствием чего "открывается" ТАТА-бокс и экспонируется достаточно протяженный участок промотора. 5'-Дистальная нуклеосома сдвигается и оказывается вблизи UAS-последовательностей, что приводит к пространственному сближению UAS с ТАТА-боксом. Это, по-видимому, облегчает процесс сборки преинициаторного комплекса. Перемещение двух нуклеосом и их репозиционирование происходят независимо друг от друга. Вторая нуклеосома сдвигается в сторону FRT-последовательности и репозици-онируется в соответствии с ее сигналом позиционирования. Индукция экспрессии не сказывается на позиционировании нуклеосом на структурной части гена. Однонаправленное скольжение (sliding) и репозиционирование нуклеосом происходят и без участия индуктора при ингибировании деацетилаз трихоста-тином А. Показан феномен "базальной" (с меньшей эффективностью) экспрессии гена NPTII при неиндуцированном GAL-CYC-промоторе или при разобщении NPTII и GAL-CYC-промотора инверсией гена. Экспрессия гена в этих случаях, вероятнее всего, направляется с ТАТА-подобного элемента FRT-последовательности. Этот элемент локализован в области, постоянно экспонированной in vivo.
Ключевые слова: нуклеосома, позиционирование, скольжение, дрожжи, экспрессия.
NUCLEOSOME POSITIONING WITHIN NEOMYCINPHOSPHOTRANSFERASE GENE (NPTII) ON YEAST PLASMID IN REPRESSED AND ACTIVE STATE, by G. I. Kiryanov1*, L. V. Isayeva1, L. N. Kintsurashvili2, M. G. Zakharova3 (1Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Moscow State University, Moscow, 119992 Russia; * e-mail: gikmsu@mail.ru; 2Center Agricultural Biotechnology, Ministry of Education and Science of Georgian Republic, Tbilisi, 380062 Georgia; Certification Center "Prodex", Moscow, 119991 Russia). Yeast recombinant plasmid containing FRT-sequence flanked by hybrid GAL-CYC promoter and NPTII gene was developed. GAL-CYC promoter contains four UAS sequences and two closely associated TATA-boxes in CYC part [1]. This construct provides galactose-inducible synthesis of neomycinphosphotransferase from NPTII gene, and, thus, resistance of
Принятые сокращения: NPTII (neomycinphosphotransferase) - неомицинфосфотрансфераза; G418 - генетицин; TSA(trichosta-tine A) - трихостатин A; UAS (upstream activating sequence) - вышележащая активаторная последовательность, энхансер; FRT (FLP recombination target) - мишень для FLP-рекомбиназы; HDAC (Histone Deacetylase) - гистондеацетилаза; HAT (His-tone Acetyltransferase) - гистон-ацетилтрансфераза.
* Эл. почта: gikmsu@mail.ru
transformed cells to G418 antibiotic. Nucleosome positioning within NPTII gene in repressed and active states was studied. Under repressive conditions (growth on glucose) stable positioning of three nucleo-somes was detected. Two nucleosomes are localized in CYC-part. One of them encompasses both TATA-boxes. The third nucleosome overlaps FRT sequence and start of NPTII gene coding sequence. All three nucleosomes show multiple positioning. It suggests possibility of nucleosome sliding along DNA. After induction of NPTII expression by galactose sliding of two nucleosomes is detected. Sliding leads to exposure of TATA-box and long promoter segment. Sliding results in stable repositioning of nucleosomes at new sites. 5'-distal nucleosome moves closer to UAS-sequences. As a results UAS becomes spatially closer to TATA-box. This proximity facilitates assembly of preinitiation complex. Nucleosomes slides independently from each other. The second nucleosome moves towards FRT-sequence and repositions at its nu-cleosome positioning signal. Galactose-induced expression does not affect nucleosome positioning with coding region of NPTII gene. Unidirectional sliding and repositioning are detected without induction after deacetylase inhibition with trichostatine A. Basal expression of NPTII gene was shown without activation of GAL-CYC promoter and after spatial uncoupling of coding sequence and promoter by gene inversion. In these cases it seems that expression is driven by TATA-like element in FRT-sequence. This element is located in permanently exposed area (in vivo data).
Key works: nucleosome, positioning, sliding, yeast, expression
В эукариотической клетке все процессы, направляемые ДНК (репликация, транскрипция, рекомбинация и т.д.), происходят на хроматиновой матрице, единицей которой является нуклеосома [2]. Упаковка ДНК в нуклеосому существенно ограничивает возможности реализации ее потенциала: репрессируется узнавание нуклеотидной последовательности специфичными к последовательности белками, в том числе факторами, регулирующими транскрипцию, взаимодействие их с ДнК, ограничиваются процессы инициации и элонгации синтеза мРНК. В настоящее время стало понятно, что клетка обладает механизмами, которые позволяют преодолеть эти ограничения.
В свете исследований, проведенных за последнее 10-летие, становится очевидным, что сама нуклеосома представляет собой единицу модуляции активности генов в ходе экспрессии. Термин "активная" нуклеосома описывает динамические изменения состояния самой нуклеосомы, октамера гистонов и отдельных участников октамера, которые определяют возможность снятия репрессивных ограничений. Открыты, широко исследуются и уточняются основные механизмы, связанные с активацией нук-леосом : АТР-зависимое ремоделирование нукле-осом, обеспечивающее изменение места посадки октамера на ДНК, обратимые ковалентные модификации гистонов октамера, изменяющие как структуру октамера и его стабильность, так и взаимодействие октамера с ДНК. В свою очередь, модификации гистонов обеспечивают изменение доступности ДНК для сайт- и последовательность-специфичных факторов.
Третий механизм изменения структуры нуклеосомы - замена гистонов их субтипами, например, гистона Н3 на Н3.3, также приводящая к образованию более релаксированной формы нуклеосомы. Роль гистонов в процессах активации нуклеосомы интерпретируется в терминах "гистонового кода".
Менее обсуждаем другой аспект регуляции активности генов, который можно рассматривать в терминах "второго кода ДНК".
Известно, что в промоторах индуцибельных генов представлены нуклеотидные последовательности, прямо определяющие сайт-специфичность взаимодействия с ними белков-активаторов. Можно привести наиболее хорошо изученные примеры: участки взаимодействия с гормон-рецепторными комплексами стероидных гормонов [3]; UAS-после-довательности (энхансеры), определяющие связывание белков-активаторов Pho2 и Pho4 (для генов, индуцируемых концентрацией фосфата), Gal4 (для генов, индуцируемых галактозой) и т.п. Следует отметить, что взаимодействие этих активаторов в клетке происходит на ДНК в составе хроматина. В ряде случаев участки узнавания активаторов находятся в составе нуклеосом и недоступны для узнавания, в других случаях белки-активаторы постоянно связаны со своими сайтами [4]. Другой аспект "второго кода ДНК" - феномен позиционирования нуклеосом. Известно, что предпочтительность связывания октамера гистонов с ДНК определяется особенностями ее структуры, в конечном итоге, нуклеотидной последовательностью [5, 6]. В настоящее время не вполне понятно, как позиционирование нуклеосом на промоторах, блокирующих узнавание ТАТА-боксов, преодолевается в ходе индукции гена. В качестве примера можно привести активацию генов PHO5, при которой происходит разборка нуклеосомы (нуклеосом), блокирующих ТАТА-бокс. В этом процессе принимают участие шапероны, удаляющие Н2А-Н2В-димеры из окта-меров [7]. Существует много примеров альтернативного решения проблемы. В опытах in vitro и in vivo показано смещение октамера гистонов с функционально значимого участка ДНК, описываемое как скольжение нуклеосом [8, 9].
Ранее мы описали позиционирование нуклеосом на модели индуцируемого галактозой промотора гена NPTII в дрожжевых плазмидах. Одно из главных наблюдений, сделанных на этих моделях, - заключение о поливариантности позиционирования нуклеосом на каждой конкретной нуклеотидной последовательности. Мы интерпретируем поливариантность как возможность скольжения нуклеосомы относительно сигнала позиционирования (аффинного или пограничного).
В представленной работе мы детализировали положение отдельных нуклеосом на GAL-CYC-ин-дуцибельном промоторе гена NPTII в репрессированном и индуцированном состоянии, оценив при этом реальный сдвиг нуклеосом. Параллельно оцен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.