БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.5, c.887-893
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.3; 57.043
ПРОБЛЕМА СОХРАНЕНИЯ СВОЙСТВ ОРГАНИЗМОВ ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ (НА ПРИМЕРЕ ГРИБОВ)
© 2009 г. Е.П. Четверикова
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская, д. 3
Поступила в р едакцию 11.01.09 г.
Светлой памяти С ергея Ивановича Розанова посвящается
В обзоре приведены результаты исследований последствий криоконсервации грибов, свидетельствующие о стабильности их мор фологии, а также ряд фактов, указывающих на изменение их свойств, о мутагенности криоконсервации. Оказалось, что исследования последних 10 лет подтвер ждают гипотезу С.И. Розанова, согласно которой кр иоконсервация должна пр иводить к увеличению р езерва наследственной изменчивости организмов.
Ключевые слова: криоконсервация, грибы, морфология, изменение свойств, мутагенность.
В связи с ускорением исчезновения видов на Земле возникло множество генетических криобанков, в которых сохраняется генофонд различных видов, в том числе редких и исчезающих. Роль криобанков в сохранении биоразнообразия рассмотрена в работах С.И. Розанова [1—3]. Согласно его концепции, криоконсервация, воздействие ультранизких температур, должна приводить к увеличению резерва наследственной изменчивости организма, рас-шир ения его адаптационных возможностей при интродукции в обедненные фитоценозы [1-4]. Им были разр аботаны подходы к реинтродук-ции видов в современные биоценозы [5-6]. Точка зр ения С.И. Розанова соответствует известному положению о том, что стрессы увеличивают изменчивость растений [7]. В лаборатории С.И. Розанова было показано, что криоконсер-вация семян диких травянистых растений в жидком азоте приводит к увеличению коэффиента вариации, характеризующего изменчивость морфологических признаков [8-10]. Доминантных мутаций у этих растений в полевых экспериментах обнаружено не было [8-11], что свидетельствует о том, что замораживание-оттаивание не является сильным мутагеном.
Гипотеза о мутагенезе в результате крио-консервации была сфор мулирована С.И. Розановым более 10 лет назад [1-6], за это время появились некоторые исследования, подтверждающие ее. Например, после замораживания семян ландыша Сопуа11апа шщаШ в жидком азоте обнаружено увеличение числа хромосомных аберраций [12]. В ряде исследований об-
наружены мутации у растений, выр ащенных из меристем, подвергнутых действию жидкого азота, - у диоскореи Dioscorea bulbifera [13], у проростков сливы [14], у регенерантов хризантемы Chrisanthemum morifolium [15]. Показано, что замораживание апикальных меристем зверобоя (Hypericum perforatum) привело к изменениям в некодирующей части генома у нескольких регенер ир ованных р а стений. У одного был потерян один из фрагментов ДНК и изменен фрагмент в области 532-587 пар оснований, у другого - изменен фрагмент в области 428 пар оснований [16]. Несколько мутаций обнаружено у проростков кукурузы, выращенных из замор оженных меристем. Об этом свидетельствует исчезновение двух изоформ из спектра амилазы и появление одной новой минорной полосы [17]. Однако в других работах не было обнаружено изменений состава нук-леотидов исследованных участках ДНК [см. обзор (18)] у регенерантов после кр иоконсервации меристем.
Вместе с тем имеются работы, в которых установлено изменение метилирования генома у регенерантов после криоконсервации. У растений ДНК метилирована на 30% с образованием 5-метилцитозина, и с уровнем метилирования ДНК связана регуляция развития, уменьшение его приводит к изменению экспрессии генов [19]. Влияние криоконсервации на степень метилирования ДНК в клетках цитрусовых было исследовано после замораживания клеточной культуры. Были обнаружены изменения -в одном из фрагментов ДНК появился мети-
лированный цитозин, которого в ДНК контр ольных клеток не было, в трех других фрагментах произошла потеря метильных гр упп [20]. В другой работе на ДНК растений садовой земляники, выращенных из криоконсервирован-ных меристем, обнаружено деметилирование нескольких фр агментов ДНК [21]. Найдены также изменения в уровне метилирования ДНК из листьев проростков миндаля, выросших из замороженных апикальных меристем [22].
Пер ечисленные исследования свидетельствуют о наличии изменений в геноме после воздействия ультранизкой температуры и оттаивания. В тоже время большое количество работ указывает на стабильность генома после крио-консервации [18], и проблема сохранения свойств цветковых растений после криоконсер-вации остается открытой.
Гипотеза С.И. Розанова [1,6] не относится именно к цветковым растениям, она может быть справедливой для криоконсервации любого живого объекта. В этом отношении привлекает внимание царство грибов. К р иомикология насчитывает около полувека, криоконсервации подвергнуто огромное количество грибов, различающихся по образу жизни - сапротрофы, питающиеся мертвым субстратом, симбионты, паразиты и хищные грибы. Они хранятся в криобанках разных стран, в России - во Всероссийской коллекции микроорганизмов [23,24].
В настоящей работе рассмотрены некоторые исследования, в которых установлено соответствие регенерированных после криоконсерва-ции грибов исходным, и те работы, в которых описано изменение тех или иных свойств после воздействия. Описание многочисленных исследований по криоконсервации грибов, касающихся методики и выживаемости различных грибов (монография [25]), в задачу настоящей работы не входит.
П РИМЕРЫ СТАБИЛЬНОС ТИ СВОЙ СТВ
ГРИБОВ ПОСЛЕ К РИОКОНСЕРВАЦИИ
Многие исследователи наблюдали неизменность внешнего вида и свойств грибов после воздействия ультранизких температур [26-35]. Оказалось, что многие грибы хорошо переносят замораживание в жидком азоте при применении относительно про стых методов консервации. У базидиомицетов родов AmШaria, Pleurotus, Plu-teus и Polyporus не было отмечено изменений морфологии и метаболизма [28,30]. Восемь видов из родов Inonotus и Pholiota не изменили интенсивности синтеза ферментов, разрушающих лигнин [27]. В работе [33] замораживание гиф в агаровых блоках проводили в 5% гли-
цер оле со скоростью 1оС/мин до -70°C и помещали сосудики в жидкий азот. Через год xp анения широкого спектр а видов из различных систематических групп выжили почти все штаммы, за небольшими исключениями, причем по скорости роста колоний, их площади, цвету, размеру гиф и их ветвлению авторы изменений не наблюдали. Стабильность фенотипа 11 видов съедобных грибов (вешенка, шампиньоны и др.) установлена после криоконсер вации их в жидком азоте. Исследование определенного участка генома грибов рода Agaricus и Pleurotus, фрагмента 5,8S рибосомальной ДНК, выделенной из мицелия, также не показало изменений нук-леотидного состава [31].
Интересны исследования, в которых происходящие в клетках процессы при понижении температуры наблюдаются в криомикроскоп [34,35]. Гр ибы замораживали в виде мицелия в агаровых блоках и реже - в виде суспензии спор. Было изучено несколько тысяч штаммов из 60 родов: большинство из них сохранили свои характеристики и только несколько процентов погибли. Замораживание проводили в шир оком диапазоне скор остей от -0,5оС/мин до -200оС/мин. Наблюдалось сжатие гиф при низких скоростях охлаждения и выход воды, или образование внутриклеточного льда при увеличении скорости. В качестве криопротек-торов применяли ДМСО или глицерол, которые часто применяются в криомикологии [25,36]. Были подобр аны оптимальные скорости о хла-ждения, при которых оба процесса сведены к минимуму. Оказалось, что разные виды и штаммы одного вида имеют различные оптимальные скорости и от таксономического положения вида они не зависят. Было установлено, что для большинства видов оптимальными являются скорости от -1 до -10°С/мин, и очень редко -200°С/мин, т.е. непосредственное погружение в жидкий азот.
Замечательно, что мицелий некоторых грибов (Aspergillus гереш и другие) хорошо переносит замораживание в жидком азоте без кри-опротекторов и при всех скоростях охлаждения [35]. Такая необычная криоустойчивость описана и для некоторых микоризных грибов [37].
Стабильность после криконсервации установлена не только по сохранению морфологических признаков, но и по биологическим свойствам грибов, жизненный цикл которых связан с другими организмами (симбионты, паразиты). Например, паразитирующий на личинке моли гриб Entomophaga maimaiga сохранял способность инфицировать личинки в течение 10 месяцев пребывания в жидком азоте [38]. Фито-патоген Podosphaera fusca полностью сохранял способность заражать хозяина, проростки цу-
кини, после хранения обезвоженных конидий при -80°C, в течение нескольких лет [32].
Среди грибов очень распространен симбиоз с р астениями, при этом гр иб получает от растения углеродное питание, а растение - воду и минеральные вещества от гриба. В случае эндомикоризы это симбиоз с травянистыми растениями, в котором мицелий гриба проходит внутри тканей и клеток корня [39]. Для эндо-микоризного гриба Glomus intraradices показано, что после криоконсервации споры прорастали и сохраняли способность колонизировать корни хозяина [40]. В другом виде микоризы (эктомикориза) мицелий гриба образует чехол из гиф на кор нях древесных р астений. Стабильность морфологических и физиологических свойств эктомикоризного гриба Cantarellus ci-barius была установлена после шести дней пребывания мицелия в жидком азоте. Замораживание проводили очень медленно, трехступенчатым методом при медленном охлаждении, начиная с -0,3оС/мин, и постепенном добавлением криопротекторов - диметилсульфоксида и сорбитола [41].
Выше описано сохранение исходных морфологических и физиологических свойств грибов после криоконсервации при ультранизкой температуре, когда останавливаются диффузия и метаболизм. Это убедительно показано для растительных тканей, находящихся в жидком азоте (для обзора см. [42]). В то же время в ряде работ [43-49] исследовано криосо хр анение простейших, и грибов в том числе, в естественных условиях, в вечномерзлых грунтах при относительно высоких температурах -10-12°С в Арктике и -27°С в Антарктиде. Эти организмы со хр а
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.