УДК 577.352
ПРИЧИНЫ НЕМОНОТОННОГО ВЛИЯНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ НА СПОСОБНОСТЬ CD4+ Т-КЛЕТОК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА К ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ АКТИВАЦИИ
© 2015 г. И. С. Литвинов*
ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
Поступила в редакцию 17.09.2014 г. Принята к печати 02.12.2014 г.
Концентрация ионов внеклеточного кальция ([Ca2+]o) оказывает немонотонное влияние на способность CD4+ Т-клеток в периферической крови человека (ПКЧ) к поликлональной активации in vitro. Зависимость исследованных параметров активации CD4+ Т-клеток от значений [Ca2+]o представляет собой кривую с двумя максимумами и локальным минимумом между ними. Один из максимумов расположен в районе нижней границы нормы по [Ca2+]o в ПКЧ, а другой — смещен в область более низких значений [Ca2+]o, характерных in vivo для патологических состояний различной природы. Возможной причиной этого могут быть различия в рецепторах на поверхности Т-кле-ток. Для проверки этого предположения было проведено сравнение рецепторзависимого (смесь моноклональных антител (мАт) к молекулам CD3 и CD28) и рецепторнезависимого (смесь форбол-миристат-ацетата с иономицином) способов активации Т-клеток в ПКЧ in vitro при разных значениях [Ca2+]o. Полученные данные свидетельствуют о ключевой роли систем внутриклеточной сигнализации Т-клеток в их неодинаковой чувствительности к ионам кальция. Другая возможная причина связана с неодинаковыми скоростями прохождения CD4+ Т-клетками in vitro основных стадий активации и дифференцировки. В рамках этого предположения были измерены доли активированных CD4+CD69+, CD4+(Tyr-P)high, CD4+CD29+ и CD4+(HLA-DR)+ Т-клеток во времени и при различных значениях [Ca2+]o. Все исследованные стадии активации и дифференцировки CD4+ Т-клеток in vitro одинаково зависели от величины [Ca2+]o. Следовательно, в неодинаковой чувствительности к ионам кальция активации CD4+ Т-клеток in vitro ключевую роль играют самые ранние стадии индукции. Это дополнительно подтверждается анализом относительных скоростей накопления долей активированных CD4+CD69+ Т-клеток при 0.4, 0.8 и 1.2 мМ EGTA. Сравнительная роль CD4+ Т-клеток памяти и их наивных предшественников была исследована в отдельной серии экспериментов. Сначала был проведен фенотипический анализ CD4+CD69+ Т-клеток в составе максимумов. Первый максимум зависимости доли активированных CD4+ Т-клеток от значений [Ca2+]o формируют в среднем 85% CD4+CD45R0highCD69+ Т-клеток памяти, а оставшиеся 15% приходятся на наивные CD4+CD45RAlowCD69+ Т -клетки. Во втором максимуме представлены практически только CD4+CD45R0+CD69+ Т-клетки памяти. Доля наивных CD4+CD45RAlowCD69+ Т-клеток редко превышала 2%. Соотношение числа CD4+CD69+ Т-клеток в этих максимумах прямо пропорционально зависит от возраста донора и представляет собой прямую с R2 = 0.9077. Наиболее вероятным кандидатом на роль CD4+ Т-клеток, способных к активации в условиях гипокальциемии, являются резистентные к действию иономицина (IR) Т-лимфоциты памяти. Для проверки этого предположения из ПК донора были выделены мононуклеарные клетки и их IR-фракция. Обе популяции клеток были активированы смесью мАт при различных значениях концентрации EGTA. В первом максимуме активируется лишь небольшая часть IR CD4+CD45RA-CD45R0+ Т-клеток памяти. Именно второй максимум соответствует активации большинства CD4+CD45RA-CD45R0+-Т-клеток памяти. Следовательно, существование двух максимумов активации CD4+ Т-клеток в условиях гипокальциемии связано с присутствием в ПКЧ двух субпопуляций CD4+ Т-клеток памяти, различающихся между собой кальцийзависимой системой внутриклеточной сигнализации.
Ключевые слова: периферическая кровь человека, активация клеток, БОТА, концентрация внеклеточного кальция, две популяции СБ4+ Т-клеток памяти, проточная цитофлуориметрия, резистентные к действию иономицина Т-клетки.
БОТ: 10.7868/80132342315040107
ВВЕДЕНИЕ
Ионы кальция играют фундаментальную роль во многих жизненно важных функциях организма и их концентрация во внеклеточных жидкостях поддерживается с поразительной точностью [1]. В сыворотке крови здоровых людей определены верхняя (1.38 мМ) и нижняя (0.93 мМ) границы нормы концентрации ионов внеклеточного кальция ([Ca2+]o) [2, 3]. Длительные отклонения величины [Ca2+]o в крови от значений нормы часто приводят к необратимым изменениям в организме [1—3]. Множество патологических состояний и самых разнообразных инфекций способны приводить в той или иной мере к падению величины [Ca2+]o за нижнюю границу нормы (гипо-кальциемии) в крови больных [2—10].
Важность поддержания величины [Ca2+]o для жизнедеятельности Т-клеток в периферической крови человека (ПКЧ) давно известна [11—13]. Кроме того, эти ионы играют одну из ключевых ролей в процессах внутриклеточной сигнализации Т-клеток, в индукции ими специфической активации и при осуществлении Т-клетками своих эф-фекторных функций. Однако, сколько-нибудь детального изучения зависимости иммунологических реакций CD4+ Т-клеток в ПКЧ от величины [Ca2+]o до сих пор не проводилось. Согласно современным представлениям, предполагается существование какого-то единого механизма чувствительности всех субпопуляций CD4+ Т-клеток в ПКЧ к значениям [Ca2+]o.
Ранее нами была показана немонотонная зависимость способности Т-клеток в ПКЧ к полик-лональной активации in vitro от величины [Ca2+]o [14, 15]. Анализ причин ее немонотонности является целью представленной работы. В работе будут проанализированы некоторые причины влияния концентрации EGTA на способность CD4+ Т-кле-ток к поликлональной активации:
— сравнительная роль специфических рецепторов на поверхности CD4+ Т-клеток в ПКЧ и систем их внутриклеточной сигнализации в процессе активации клеток в условиях гипокальциемии in vitro;
Сокращения: мАт — моноклональные антитела; ПКЧ — периферическая кровь человека; ФМА — форбол-миристат-ацетат; ФСБ — фосфатно-солевой буфер; ФСК — феталь-ная сыворотка коровы, [Са2+]0 — концентрация ионов внеклеточного кальция; БОТА — этиленгликоль-бис(2-ами-ноэтиловый эфир^ЛЛЛ'Л'-тетрауксусная кислота; HEPES — Л-(2-гидроксиэтил)пиперазин-Л '-(2-этансуль-фоновая кислота); Ш-Т-клетки — СВ4+Т-клетки, резистентные к действию иономицина.
#Автор для связи (тел.: (499) 330-72-65, факс: (495)330-40-11, эл. почта: catlismar@gmail.com).
— влияние концентрации EGTA на последовательные стадии процесса активации CD4+ Т-кле-ток в ПКЧ in vitro;
— влияние концентрации EGTA на кинетику накопления активированных CD4+CD69+ Т-клеток в ПКЧ in vitro;
— сравнительная роль CD4+ Т-клеток памяти в ПКЧ и их наивных предшественников в процессе активации клеток в условиях гипокальциемии in vitro;
— особенность влияния концентрации EGTA на способность CD4+ Т-клеток памяти и их IR-фрак-ции к активации в условиях гипокальциемии in vitro.
Кроме того, предполагается рассмотреть "физиологический смысл" обнаруженного феномена.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Рецепторзависимая и рецепторнезависимая
активация Т-клеток при различных значениях [Ca2+]o в ПКЧ in vitro
Наиболее простым объяснением немонотонного влияния концентрации EGTA на способность CD4+ Т-клеток в ПКЧ к поликлональной активации может быть неодинаковая Са2+-зависимость эффекторных белков и рецепторов на их поверхности. Поликлональную активацию Т-клеток in vitro наиболее часто осуществляют либо смесью ФМА с иономицином, либо смесью мАт к CD3-компонен-те Т-клеточного рецептора и мАт к молекулам ко-стимуляции CD28 [16—19]. В первом варианте ФМА отвечает за активацию внутриклеточных про-теинкиназ, а иономицин — за резкое повышение концентрации Ca2+ в клетках [17, 18]. Сочетание этих сигналов хорошо имитирует известную последовательность внутриклеточных реакций, необходимых для успешной активации Т-клеток in vitro. В этом случае активация Т-клеток происходит независимо от эффекторных белков и рецепторов на их поверхности и прямо определяется только особенностями функционирования систем внутриклеточной сигнализации. Согласно современным представлениям, использование смеси мАт позволяет наиболее точно имитировать взаимодействие Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками, которое необходимо для их успешной активации in vivo и in vitro [16, 17, 20]. (В дальнейшем, если это только не оговорено дополнительно, под выражением "активированные CD4+ Т-клет-ки" следует понимать "поликлональную активацию CD4+ Т-клеток с помощью смеси мАт к молекулам CD3 и CD28 в составе ПКЧ in vitro".)
С целью обеспечения наглядности материала, для сравнительного анализа влияния концентрации EGTA на способность Т-клеток в ПКЧ к по-ликлональной активации этими двумя способами и удобства читателей, авторы позволили себе
привести уже опубликованные данные [14, 15]. На этих кривых, приведенных на рис. 1, доли активированных Т-клеток в ПКЧ (СВ4+СЭ69+ и СВ3+СЭ69+ Т-клетки соответственно) при каждой концентрации БОТА были нормированы на соответствующие им величины параметров при значении [Са2+]0 в ПКЧ, максимально близком к 1.0 мМ. Полученные зависимости приведены на рис. 1 и описывают сходные по форме кривые. Кривые зависимости долей СВ4+СЭ69+ и СВ3+СЭ69+ Т-клеток от концентрации БОТА подобны и представляют собой суперпозицию двух максимумов и локального минимума между ними.
Качественное сходство кривых на рис. 1 может быть объяснено следующим образом. Как было уже отмечено выше, активация Т-клеток в ПКЧ смесью смесью ФМА с иономицином не зависит от белков клеточной поверхности и связана с взаимодействием этих веществ внутри Т-клеток с протеинкиназами и кальциевыми депо. Скорее всего, именно внутриклеточные системы сигнализации Т-клеток определяют влияние снижения [Са2+]0 на способность Т-клеток в ПКЧ к активации описанными выше двумя способами. Таким образом, обнаруженная немонотонность влияния концентрации БОТА на способность Т-кле-ток в ПКЧ к поликлональной активации может быть объяснена закономерностями функционирования в них систем внутриклеточной сигнализации, а не влиянием [Са2+]0 на активность разнообразных белков (ферментов, к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.