УДК 535.21
ПРИМЕНЕНИЕ ФЕМТОСЕКУНДНЫХ ЛАЗЕРНЫХ ИМПУЛЬСОВ В БИОМЕДИЦИНСКИХ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ
© 2013 г. И. В. Ильина1, А. В. Овчинников1, Д. С. Ситников1, М. М. Ракитянский1, М. Б. Агранат1, Ю. В. Храмова2, М. Л. Семенова2
Объединенный институт высоких температур РАН, Москва 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет
E-mail: ilyina_inna@mail.ru Поступила в редакцию 31.03.2011 г.
В статье сообщается о результатах работ, проводимых в ОИВТ РАН в области разработки оборудования, методик исследований и технологий для биологии и медицины. На основе нового поколения инфракрасных фемтосекундных лазеров разработаны и изготовлены экспериментальные образцы лазерного пинцета, скальпеля и комбинированной системы "пинцет—скальпель". В данной работе приведены результаты экспериментальных исследований по бесконтактному слиянию клеток млекопитающих (бластомеров эмбрионов мыши 1.5 суток развития) с помощью фемтосекундных лазерных импульсов.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время клеточные технологии представляют собой быстро развивающееся направление, с которым связывают будущее медицины. С их помощью становится возможным получение клеточных продуктов, способствующих восстановлению функций тканей и органов человека, или пригодных для тканевой инженерии. Не менее важная задача адресной доставки в организм человека лекарственных средств также может быть решена с помощью биомедицинских клеточных технологий.
Применение современной лазерной техники значительно способствует развитию клеточных технологий. Особенно перспективным является использование лазерных импульсов ультракороткой длительности (10—100 фс). Во-первых, фем-тосекундные лазеры зарекомендовали себя как эффективный исследовательский инструмент, применяющийся, например, для изучения быст-ропротекающих процессов (фемтосекундная спектроскопия [1]) или диагностики объемных микроструктур (биообъектов) с субмикронным разрешением (многофотонная микроскопия [2]). Во-вторых, фемтосекундные лазеры могут использоваться в качестве источников излучения для воздействия на живые объекты (ткани, клетки, клеточные органеллы) с целью изменения структур или функций последних [3] не только в фундаментальных исследованиях, но и в клинической практике. Так, например, фемтосекундные лазеры успешно применяются в офтальмологии для лечения катаракты и роговицы (метод Фемто-ЬА81К) [4]. Со временем фемтосекундные
лазеры могут стать незаменимыми инструментами и в области регенеративной медицины [5], одной из наиболее быстро развивающихся биомедицинских технологий. Например, весьма перспективным представляется использование лазерных импульсов фемтосекундной длительности для решения важной задачи регенеративной медицины, связанной с репрограммирова-нием клеток [6]. Известно, что одной из методик, применяющихся для репрограммирования клеток, является слияние клеток (cell fusion) [7, 8].
В настоящей работе будет показано, что слияние клеток может быть выполнено в полностью бесконтактном режиме, без использования механических инструментов, химических реагентов или электрических полей, с помощью лазерного скальпеля, разработанного на базе фемтосекунд-ного лазера. На модельных клетках — двухклеточ-ных эмбрионах мыши — продемонстрирована возможность эффективного слияния клеток при воздействии однократного фемтосекундного лазерного импульса (ФЛИ). В ходе экспериментов были достигнуты высокие показатели эффективности слияния (до 89%) и выживаемости клеток (до 50%), подвергнутых процедуре фемтосекунд-ного лазерного слияния.
ОБОРУДОВАНИЕ И ТЕХНОЛОГИИ,
РАЗРАБАТЫВАЕМЫЕ В ОИВТ РАН
В лаборатории Лазерного воздействия ОИВТ РАН, помимо изучения ударно-волновых явлений, протекающих при воздействии фемтосе-кундных импульсов [9], исследований в области фемтосекундной лазерной абляции [10], генера-
ции характеристического рентгеновского излучения [11] и рентгеновской радиографии [12], около пяти лет проводятся исследования по применению фемтосекундных лазеров в биологии и медицине, разрабатывается новое оборудование, методики исследований и технологии. В настоящее время разработаны и изготовлены экспериментальные образцы лазерного пинцета, скальпеля и комбинированной системы "пинцет—скальпель" (рис. 1), производство которых планируется осуществлять в рамках проекта Роснано. В качестве источников фемтосекундных импульсов применяются следующие типы фемтосекундных лазеров, разработанных и изготовленных в России (Авеста-проект):
♦ импульсно-периодический лазерный генератор инфракрасных фемтосекундных импульсов с длиной волны излучения 1048 нм, работающий с частотой следования импульсов V = 71 МГц;
♦ фемтосекундный волоконный лазер с усилителем мощности с длиной волны излучения 1040 нм, работающий в режиме одиночных импульсов и с частотой повторения до 10 кГц;
♦ лазер на основе активной среды хром-форстерит с длиной волны излучения 1240 нм, работающий в импульсно-периодическом режиме.
Разработанное оборудование на сегодняшний день используется в ОИВТ РАН для проведения исследований с целью разработки технологий клеточной микрохирургии, в частности эмбриональной лазерной микрохирургии, гибридизации (слияния) клеток, лазерной трансфекции. Совместно с Биологическим факультетом МГУ с помощью лазерного пинцета и фемтосекундного лазерного скальпеля разработана процедура бесконтактной биопсии эмбрионов млекопитающих, необходимая для проведения преимпланта-ционной диагностики состояния эмбриона [13, 14]. Разработана методика слияния тел нейронов
беспозвоночного моллюска Ьушпаеа 81а§па1*5. Помимо этого одним из приоритетных направлений исследований является оптическая трансфекция, которая может эффективно осуществляться с помощью фемтосекундных лазерных импульсов. В настоящее время совместно с Институтом биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН методика отрабатывается на различных клеточных культурах (включая стволовые клетки).
БЕСКОНТАКТНОЕ СЛИЯНИЕ
КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ПОМОЩЬЮ ФЕМТОСЕКУНДНОГО ЛАЗЕРНОГО СКАЛЬПЕЛЯ
Основные принципы технологии оптической гибридизации клеток зарождались еще в 80-е годы прошлого века [15, 16]. Было показано, что слияние клеток с помощью лазерного излучения обладает рядом преимуществ по сравнению с альтернативными методиками: позволяет производить избирательное и контролируемое слияние заданных клеток (в отличие от химических агентов и инактивированных вирусов, осуществляющих массовую гибридизацию) в бесконтактном режиме, с соблюдением условий стерильности. При этом для лазерного слияния в основном применялись импульсные диодные (340—370 нм) [16—18] или твердотельные лазеры (вторая гармоника Nd:YAG-лазера, 530 нм) [19]. Была продемонстрирована возможность слияния клеток при помощи наносекундных лазерных импульсов с энергиями ~ 1—1.5 мкДж и частотой следования импульсов 10—100 Гц. При использовании фемто-секундных лазеров, как будет показано далее, для слияния клеток достаточно воздействия импульсов с энергией порядка десятков наноджоулей, что значительно снижает риск повреждений и уменьшает тепловую нагрузку на ткани, непосредственно прилегающие к зоне воздействия. За
Осветитель микроскопа (лампа/флуоресцентная приставка)
Призма
Конденсор
2-х координатный столик (X—Y)
Телескоп
Объектив
Зеркало
Осциллограф
ПЗС-камера Фотодетектор
Рис. 2. Оптическая схема экспериментальной установки лазерного скальпеля.
счет эффективной локализации ФЛИ во времени и в пространстве обеспечивается высокая точность воздействия на объекты. Поэтому применение фемтосекундных лазеров для слияния клеток выглядит наиболее перспективным и потенциально может привести к повышению эффективности слияния клеток и их выживаемости.
В качестве модельных клеток для разработки технологии фемтосекундного лазерного слияния по нескольким причинам были выбраны эмбрионы мыши 1.5 сут развития на стадии двух бласто-меров. Во-первых, на данной стадии развития эмбриона между бластомерами существует область плотного межклеточного контакта, поэтому применение дополнительных механических, оптических или химических способов для приведения клеток в контакт друг с другом не требуется. Во-вторых, использование данных клеток позволяет получить достоверные данные относительно жизнеспособности и дальнейшего развития клеток, подвергнутых процедуре лазерного слияния.
В экспериментальных исследованиях по слиянию клеток использовалась лазерная система на основе активной среды хром-форстерит, которая позволяла получать импульсы длительностью ~100 фс на длине волны генерации 1240 нм. Принципиальная схема экспериментальной установки представлена на рис. 2. Лазерная система собрана по схеме усиления чирпированных импульсов и состоит из задающего генератора, временного расширителя импульса (стретчера), регенеративного усилителя и временного компрессора. Задающий генератор формирует непрерывный цуг фемтосекундных импульсов с частотой следования 80 МГц и энергией 2 нДж. Накачка активной среды задающего генератора осуществляется лазером МП-1ета Ж, работающим в режиме непрерывной гене-
рации на длине волны 1064 нм, мощность — 10 Вт. В регенеративном усилителе энергия импульса увеличивается до 750 мкДж и на выходе лазерной системы после сжатия во временном компрессоре составляет ~500 мкДж. Для накачки активной среды регенеративного усилителя используется им-пульсно-периодический лазер LS2137 (Lotis TII), работающий в режиме модуляции добротности. Длительность импульса составляет 10 нс, энергия — 30 мДж, а частота повторения импульсов — 10 Гц. Измерение длительности фемтосекундного импульса и настройка временного компрессора осуществлялись с помощью автокоррелятора AS FT (Авеста-проект). В качестве излучения лазерного скальпеля используется излучение второй гармоники (длина волны — 620 нм) фемтосекундной хром-форстерит лазерной системы. Для этого был установлен преобразователь, изготовленный из кристалла DKDP. Коэффициент преобразования излучения на длине волны 1240 нм в излучение на длине волны 620 нм достигает 5%. Излучение с помощью диэлектрических зеркал, изготовленных для эффективного отражения излучения
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.