ПОВЕРХНОСТЬ. РЕНТГЕНОВСКИЕ, СИНХРОТРОННЫЕ И НЕЙТРОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ, 2015, № 3, с. 49-54
УДК 539.1.04:54-11
ПРИМЕНЕНИЕ ПОЗИТРОННОЙ АННИГИЛЯЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОТОДЕСТРУКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН © 2015 г. Л. В. Ельникова
НИЦ "Курчатовский институт", ГНЦРФ Институт теоретической и экспериментальной физики,
117218 Москва, Россия E-mail: elnikova@itep.ru Поступила в редакцию 20.08.2014 г.
В обзоре обсуждаются возможные терапевтические приложения методов позитронной аннигиля-ционной спектроскопии (ПАС) с пучками позитронов низких энергий. Они применяются для изучения дефектной структуры слоев вещества микро- и субмикрометровых размеров (это приповерхностные слои в электронных устройствах, клеточные стенки и жидкокристаллические агрегаты в биомедицинских приложениях и пр.). Рассмотрена модель анализа с помощью временного метода ПАС состояний мембран облученных бактериальных клеток в цикле фотодинамической терапии, которая заключается в уничтожении или необратимом окислительном повреждении патогенных клеток, фотоинактивированным кислородом фотосенсибилизатора, введенного в клетку-мишень непосредственно перед световым воздействием.
Ключевые слова: фотодинамическая терапия, активная форма кислорода, бактериальные мембраны, спектроскопия позитронной аннигиляции.
DOI: 10.7868/S0207352815030099
ВВЕДЕНИЕ
Позитронная аннигиляционная спектроскопия находит широкое применение в медицинских задачах ввиду ее высокой чувствительности к внутренней структуре вещества, в том числе жидкокристаллических агрегатов, составляющих основные строительные блоки органической материи.
В настоящее время в исследованиях жидких сред используются источники позитронов двух типов. Во-первых, это Р+-активные изотопы с непрерывным энергетическим спектром позитронов до 1—2 МэВ активностью 106—109 е+/с и размером активного пятна 5—10 мм. Аннигиляция позитронов при использовании такого источника происходит на глубине исследуемого объекта 0.1—1 мм [1]. Второй тип — это высокоэнергетические пучки моноэнергетических позитронов, они применяются в современных диагностических задачах, где требуется получить информацию об объектах, локализованных в областях микронных и нанометровых размеров.
Позитроны для моноэнергетического пучка получают двумя способами:
1. С использованием Р+-активных изотопов или путем рождения е+—е--пар при поглощении в веществе у-излучения с энергией, превышающей массу покоя е+—е--пары (1.02 МэВ). Затем в модераторе позитроны замедляются до тепловых
энергий, диффундируют к поверхности и излучаются в окружающее пространство с энергией, равной работе выхода позитронов (1—2 эВ). После этого с помощью электрических и магнитных полей происходит формирование и ускорение полученного пучка моноэнергетических позитронов.
2. С использованием е+—е--пар, образующихся при поглощении высокоэнергетического у-из-лучения, возникающего в активной зоне ядерного реактора при делении ядер, у-излучения при ядерных (n, у)-реакциях, а также тормозного и синхротронного излучения [1].
Источники медленных моноэнергетических позитронов, базирующиеся на синхротронных установках (например, SPring-8 на кольцевом ускорителе в Рикене) и исследовательских реакторах (например, IRI в Делфе, FRM II в Мюнхене, ILL в Гренобле) [1, 2] могут испускать частицы с энергиями до 30 кэВ.
Настоящая работа посвящена приложениям методов позитронной аннигиляционной спектроскопии (ПАС), использующих источники обоих типов, в фотодинамической терапии (ФДТ), что до сих пор не имеет практической реализации, но достаточно развито на отдельных компонентах, составляющих фотодинамический цикл. Так, некоторые приложения ПАС как новой неразрушающей техники для определения молекулярного повреждения под действием УФ-облучения описаны в
4
49
[3] и ссылках. Эксперименты на мышах, облученных УФ-светом, и раковых клетках кожи [4] ярко демонстрируют перспективность метода ПАС в медицине.
В фотодинамической терапии реакции фотосенсибилизации — это процессы, в которых поглощение света фотосенсибилизатором (красителем) индуцирует химические изменения во внешних стенках вблизи поверхности некоторых типов клеток бактерий и дрожжей, увеличивает их проницаемость и позволяет значительному количеству фотосенсибилизатора (ФС) аккумулироваться на уровне цитоплазматической мембраны. Возможно протекание двух типов реакций ФДТ: через радикальный механизм (тип I) и через перенос энергии для стимуляции образования реактивного синглетного кислорода (тип II). Бактериальные клетки-мишени классифицируются как грамположительные (Грам(+), например кокки, такие как Enterococcus seriolicida, и палочковидные) и грамотрицательные (Грам(-), например, Escherichia coli (E. coli). Грам(+) и Грам(-) отличаются друг от друга, в том числе структурой слоя клеточной мембраны и его толщиной; в большинстве своем грамположительные бактерии имеют однослойную клеточную мембрану и не имеют внешней клеточной мембраны, как грамотрицательные. Положительный заряд ФС образуется для промотирования сильного электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными участками внешней поверхности многих типов бактериальных клеток. Синглетный кислород Ю2 — это несколько метаста-бильных состояний триплетного кислорода O2, но с более высокой энергией. Они менее стабильны, чем триплетный кислород O2. Разность энергии самого низкого уровня синглетного кислорода и самого низкого уровня триплетного
кислорода составляет 11400 К (Te(a1Ag ^ X32-) = = 0.98 эВ (= 94.2 кДж/моль)) и соответствует переходу в ближнем ИК-диапазоне (~1270 нм).
Теория молекулярных орбиталей предсказывает три низколежащие возбужденные синглетные состояния триплетного молекулярного кислорода 02(ХзЕ-): O2(a1Ag), O2(a'1 Ag) и O2(b Z+), которые отличаются друг от друга только спинами и заполнением разрыхляющих вырожденных орбита-лей ng. Среди этих состояний именно O2(a1Ag) принято называть "синглетным кислородом", поскольку это состояние невырожденное и наиболее долгоживущее. Благодаря различию электронных оболочек синглетный и триплетный кислород обладают разными химическими свойствами. Время жизни синглетного кислорода в вакууме равно 72 минутам, и значительно меньше — в среде. Синглетный кислород вступает в реакцию со многими типами биомолекул, в том числе с ДНК, протеинами и липидами [5].
Как наблюдалось в эксперименте [3], долгожи-вущие компоненты орто-позитрония (o-Ps) проникают на глубину 10—15 нм во внешний слой клетки. Подразумевается, что такие масштабы сопоставимы с проникновением кислорода фотои-нактивированного красителя во внешний слой грамотрицательных бактерий, они достаточно точно соответствуют размерам пуринов и липополи-сахаридов.
Эти знания мотивируют дальнейшие исследования в направлении применения методов ПАС в фотодинамической терапии. Для будущих экспериментальных подтверждений сказанного и реализации конкретных медицинских задач необходимо провести оценки позитронных состояний и реакций позитрония в фотоинактиви-рованных системах. Рассмотрим фотооблучение бактерии E. coli и порфиринового фотосенсибилизатора, мезозамещенного 4^-метил-пиридина (T4MPyP), в присутствии агента Tris-EDTA и проведем оценки ожидаемых позитронных и позитро-ниевых аннигиляционных спектров.
СИСТЕМА С ГРАМ(-) БАКТЕРИЕЙ В ЦИКЛЕ ФДТ
Рассмотрим фотосенсибилизацию E. coli видимым светом от 250-ваттных ртутных ламп для красителя T4MPyP, согласно процедуре фотоинактивации ([6] и рис. 1). Присутствие агента Tris-EDTA [6, 7] должно служить увеличению мембранной проницаемости и способствовать проникновению фототоксичных молекул в цитоплазматическую мембрану. Добавление агента Tris-EDTA к грамот-рицательным бактериям необходимо для удаления двухвалентных катионов (Ca2+, Mg2+), которые присутствуют в большом количестве для стабилизации соседних отрицательно заряженных молекул липополисахаридов на внешней стороне мембраны.
Клетки инкубируются в 8.4 мкМ порфириновом растворе (1 мл) в течение 5 мин при 37°C, клеточные гранулы промываются однократно в 5 мМ фосфатном буфере при pH 7.4 и очищаются 2% водным раствором SDS для того, чтобы разрушить клетки и обеспечить слияние порфиринов в мономерное состояние сурфактантных мицелл. Максимум поглощения T4MPyP достигается на длине волны 424 нм, его коэффициент экстинк-ции равен 194 M-1 • см-1, а соответствующий квантовый выход сиглетного кислорода равен 0.74 [7].
Пусть, например, в пробирке Pyrex помещается 106 клеток/мл. Выживаемость клеток контролируется согласно стандартной процедуре [7]: после 1, 5 и 10 мин облучения при концентрации T4MPyP 8.4 мкМ выживаемость E. coli составила 1.0, 7.94 х 10-4 и 3.16 х 10-5.
Из биохимического анализа фотооблученных клеток полагается [8], что цитоплазматическая
ПРИМЕНЕНИЕ ПОЗИТРОННОЙ АННИГИЛЯЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
51
Пурин
Пептидогликан— липопротеин
Периплазматическое пространство
Липополисахарид Внешняя мембрана
Пептидогликан
Цитоплазматическая мембрана
10-15 нм
Цитоплазма
Рис. 1. Структура клеточной стенки Грам(-) бактерий, содержит толстый внутренний слой, составленный из 2-3 слоев пептидогликана (толщиной 2-3 нм), периплазматическое пространство и внешний липидный бислой (7 нм). Внешняя мембрана содержит фосфолипиды, липопротеины, липополисахариды и протеины [6].
мембрана является наиболее важным целевым объектом фотопроцесса. Чтобы поразить эту мембрану извне, синглетный кислород должен разрушить внешний слой клетки (рис. 1). В частности, в результате повреждения должен произойти фазовый переход или образование пор во внешнем ли-пидном слое клетки. В этой связи уместно вспомнить исследования методами ПАС, доплеровского уширения спектральной линии и временного метода, липидов DPPC (БР—а дипалмитоилфосфа-тидилхолина) [9], хотя и проводившихся вне конкретных терапевтических задач.
Далее рассмотрим основные результаты фотодеструктивных реакций фотосенсибилизаторов и химических агентов в структуре бактериального слоя, а также образование атома позитрония (Р8) в системах после оптического облучения.
Реакции синглетного кислорода. Пусть син-глетный кислород в фотопроц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.