УДК 577.112:616
ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТЕОМНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ АНАЛИЗА МЫШЕЧНЫХ БЕЛКОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В МЯСНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ (ОБЗОР)
© 2014 г. С. С. Шишкин, Л. И. Ковалёв, М. А. Ковалёва, А. В. Иванов,
Л. С. Ерёмина, Э. Г. Садыхов
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: shishkin@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 09.09.2013 г.
В обзоре кратко представлены материалы по накоплению арсенала протеомных технологий, которые в 2006—2013 гг. стали активно применяться для изучения мышечных белков сельскохозяйственных животных, используемых в мясной промышленности. Отмечено, что основные направления в таких исследованиях связаны с определением изменений мышечных белков в процессах посмертного автолиза, а также с поиском видоспецифичных и других белковых биомаркеров. Рассмотрены отдельные разработки методов контроля за состоянием мышечных белков на основе протеомных исследований. Проанализированный опыт позволяет сделать заключение о перспективности развития данного направления для решения ряда актуальных вопросов прикладной биохимии.
DOI: 10.7868/S0555109914050110
Современная протеомика представляет собой специализированную биохимическую научную дисциплину, основными объектами исследований которой являются так называемые протеомы одноклеточных и многоклеточных организмов (от бактерий до млекопитающих, включая человека), а также субпротеомы отдельных клеточных структур [1—3]. Протеомика предусматривает также изучение разнообразных изменений белкового состава (протеомных профилей) клеток и тканей при физиологических и патологических процессах. Ключевой для этой дисциплины термин "протеом", обозначающий белковый комплемент экспрессирующегося генома, впервые был предложен в докладах участников Международной конференции "2D-Electrophoresis: from Protein Maps to Genomes" (Сиена, Италия, 1994). Основные материалы этой конференции были опубликованы в 1995 г. в специальном выпуске журнала "Electrophoresis" [4]. Именно в этом издании появились и первые статьи, в которых была использована протеомная терминология [4, 5].
Методология протеомики, основывающаяся на системном подходе к анализу белков (или точнее белковых продуктов генной экспрессии, БПГЭ) и устанавливаемых взаимоотношениях ген ^ БПГЭ, была разработана в конце прошлого века [6—8] на основе технологии высокоразрешающего фракционирования белков методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле [9, 10]. К настоящему времени методический арсенал протеомики располагает разнообразными технологиями и методами анализа, что нахо-
дит отражение в многочисленных публикациях по данной тематике. Ежегодно с ключевым словом "рго1еоше" выходят тысячи статей, издаются десятки специализированных протеомных журналов и монографий. В частности, в течение первых 10 лет так называемого постгеномного периода развития (2001—2011 гг.) науки отмечалась выраженная динамика роста протеомных публикаций, учитываемых в базе данных РиЪМеё МСБ1, с постепенным выходом на уровень около 6000 публикаций в год (рис. 1). Далее в 2012 г. и 2013 г. публиковалось и аннотировалось уже около 7000 работ ежегодно.
Как видно из рис. 1, пока только небольшая часть в потоке протеомных публикаций посвящена мышечным белкам (~3—4%), хотя изучение указанных белков относится к числу традиционных областей биохимии. При этом многие аспекты протеомных исследований мышечных белков животных определяются тем, что данные белки являются важнейшей составляющей различных мясных продуктов [11—13].
По имеющимся оценкам доля мясных продуктов в пищевом рационе жителей разных стран широко колеблется, но считается, что именно количество и качество мясных продуктов оказывают существенное влияние на состояние здоровья потребителей [14—16]. Как следствие в первое десятилетие 21 века важное место в биохимии питания заняли разработки так называемых функциональных мясных продуктов, а также стратегии их применения [14, 16]. При этом одним из актуаль-
8000 г
7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
Рис. 1. Динамика роста протеомных публикаций, учтенных в базе данных РиЪМе(! КСБ1 за период 2001—2013 гг. (столбцы 1—13 соответственно). I — общее число публикаций; II — протеомные публикации о мышечных белках.
. □ I Ж " г 1
_ 11111 ■ 1 1 1 1 |
_ , тж 1 71 1 73 1 75 1 я 1 я 1 И 1 Ш 1 Ж 1 я
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ных направлений стало использование протеомных технологий, которые открывают новые возможности для решения различных прикладных задач, в частности разработки методов контроля качества на основе анализа белковых биомаркеров [16—17]. В обзорах в качестве молекулярных биомаркеров рассматривались определенные белки, которые могут служить индикаторами нормальных или патологических процессов в организме (включая особенности генной экспрессии), а также видовой или тканевой принадлежности изучаемых биообразцов [18, 19].
В целом, целью данного обзора стало обобщение результатов использования протеомных технологий для изучения мышечных белков сельскохозяйственных животных, используемых в мясной промышленности.
ПРОТЕОМНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРИ ИЗУЧЕНИИ БЕЛКОВ МЫШЕЧНЫХ ТКАНЕЙ ОТДЕЛЬНЫХ ВИДОВ
МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ПТИЦ
Известно, что создание П. О'Фарреллом метода высокоразрешающего фракционирования белков с использованием двумерного электрофореза (ДЭ) в полиакриламидном геле [9] положило начало исследованиям в области протеомики. Вскоре ДЭ по О'Фарреллу приобрел значительное распространение при различных исследованиях БПГЭ [10], затем стал методической основой для дальнейшего развития протеомики [8] и в различных модификациях широко применяется до настоящего времени [1, 2, 12, 13, 20, 21].
Принципиальной особенностью ДЭ по О'Фарреллу является то, что в процессе анализа сначала проводится изоэлектрофокусирование (ИЭФ), а
затем колонка полиакриламидного геля (ПААГ) с разделенными в ходе ИЭФ белками используется в качестве стартовой зоны, от которой начинается фракционирование предварительно обработанных додецилсульфатом натрия белков во втором направлении методом электрофореза в пластине ПААГ. Такое сочетание позволяет достигать чрезвычайно высокой разрешающей способности метода и обеспечить получение на двумерных элек-трофореграммах (2-ЭФ) сотен и даже тысяч белковых фракций.
Белковые зоны в гелевой пластине обычно окрашивают органическими красителями или нитратом серебра или визуализируют каким-либо другим способом. В итоге результат фракционирования представляет собой прямоугольную пластину, на которой размещается множество окрашенных пятен — белковых фракций. Как следствие выявленные белковые фракции можно описывать в единой системе — в прямоугольных координатах, где одной из координат каждой фракции оказываются показатели р1, а другой — молекулярная масса (Мм) [9, 10]. Общая схема проведения двумерного электрофореза по О'Фарреллу описана во многих монографиях и обзорах, например [10, 22—24].
В целом, ДЭ по О'Фарреллу можно признать особой технологией, представляющей собой совокупность нескольких методов, процессов и материалов, предназначенных для решения широкого круга научных и прикладных задач в биохимии белков [6, 7, 10, 22]. Прямым следствием создания и широкого использования ДЭ по О'Фарреллу стали разработки стратегии применения системного подхода к исследованию белков [6, 7, 10, 22], которая сохранила актуальность до настоящего времени (табл. 1).
Таблица 1. Основные этапы в стратегии системного подхода к исследованиям белков (БПЭГ) и способы их реализации [6, 7, 10, 20, 22, 23]
№ Основные этапы в стратегии системного подхода Способы реализации
1 Солюбилизация максимально возможного числа белков — объектов анализа Использование при гомогенизации биопсийных образцов лизирующего раствора с 8 М мочевиной и детергентами
2 Фракционирование солюбилизированных белков на основании двух различных физико-химических свойств, отражающих особенности их первичной структуры Применение модификаций двумерного электрофореза по О'Фарреллу, сочетающих независимые методы разделения по pi и Mм (с изоэлектрофокусированием в амфолино-вом или в иммобилиновом (IPG) градиентах pH, а также неравновесный электрофорез в градиенте pH — NEPHGE)
3 Выявление белковых фракций после разделения с помощью высокочувствительных методов детекции Окрашивание гелевых пластин несколькими способами, обеспечивающими высокую чувствительность
4 Системное описание распределения белков на 2-ЭФ с использованием прямоугольных координат Проведение гель-документации коллекции 2-ЭФ, построение синтетических изображений — двумерных карт
5 Идентификация известных и выявление ранее не описанных белков в изучаемом объекте Иммунохимические, масс-спектрометрические и другие виды идентификации
6 Создание баз данных белков, составляющих изучаемый объект Обобщение результатов системного изучения белков
Особо надо отметить, что, начиная с последнего десятилетия 20 века, в рамках этой стратегии идентификация белковых фракций проводится в основном с помощью масс-спектрометрии (MQ MS) и с использованием биоинформационных технологий [25-27].
Так, большую популярность приобрели две МС-технологии, использующие в различных модификациях так называемую недеструктивную ионизацию и обозначаемые аббревиатурами MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, лазерная десорбция-ионизация из матрицы) и ESI (Electro Spray Ionization, электроспрейная ионизация) [27-30].
Реализация технологии MALDI предусматривает несколько основных шагов:
— взаимодействие анализируемых пептидов или белков с матрицами, в качестве которых используют различные органические соединения (например, a-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid [31]), выступающие в качестве доноров протонов;
— ионизация и десорбция пептидов под воздействием коротких лазерных импульсов (2—5 нс);
— получение масс-спектров образовавшихся ионов с помощью специальных приборов — время-пролетных (Time-of-Flight, TOF) масс-спектрометров (TOF-анализаторов).
На рис. 2а представлена принципиальная схема одной из протеомных технологий (так называемые
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.