БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 3, с. 221-229
УДК 576:576.08:577.115
ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЯ ЛИПИДОВ В ЛИПИДНЫХ ТЕЛЬЦАХ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ ДЕЙСТВИИ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ И МЕТИЛ-р-ЦИКЛОДЕКСТРИНА
© 2013 г. Е. М. Фок*, Е. В. Федорова, Р. Г. Парнова
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223 Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44; *электронная почта: efock@mail.ru Поступила в редакцию 3.10.2012 г.
Липидные тельца (ЛТ) — динамические клеточные органеллы, вовлеченные в различные процессы клеточного метаболизма и внутриклеточной сигнализации. Их ядро состоит, главным образом, из триацилглицеринов (ТАГ) и эфиров холестерина (ЭХ). Работа посвящена использованию проточной цитометрии для количественного анализа изменения уровня липидов, окрашенных флуоресцентным красителем нильским красным (НК), в ЛТ эпителиальных клеток. Объектом исследования служили нефиксированные свежевыделенные эпителиальные клетки мочевого пузыря лягушки Rana temporaria, обладающие мелкими, диффузно локализованными в цитоплазме ЛТ. В качестве экспериментальных воздействий использовали арахидоновую кислоту (АК), известного стимулятора образования ЛТ, и метил-Р-циклодекстрин (МрЦД), применяемого для селективного извлечения холестерина из липидных рафтов плазматической мембраны. Клетки инкубировали с 10—50 мкМ АК в течение 1 ч или с 400—2000 мкМ МрЦД в течение 30 мин, после чего окрашивали НК и определяли флуоресценцию (1возб = 488 нм, А,эм = 575 ± 15 нм) на проточном цитометре; в этих же клетках анализировали боковое светорассеяние (SS). Инкубация клеток с АК дозозависимо увеличивала флуоресценцию НК. Эффект при использовании максимальной концентрации АК составил 41 ± 2.2% и 15 ± 3.4% (p < 0.001) для флуоресценции НК и величины SS соответственно. Анализ содержания липидных классов в клеточных экстрактах выявил увеличение в присутствии 10 мкМ АК соотношения ТАГ к холестерину в 1.7 раза, к фосфолипидам — в 1.8 раза (p < 0.001). МрЦД, начиная с концентрации 400 мМ, дозозависимо снижал флуоресценцию НК и величину SS, его эффект при использовании этой дозы сопровождался уменьшением относительного уровня холестерина на 6% (p < 0.01) и эфиров холестерина на 21% (p < 0.001). Это свидетельствует о расходовании ЭХ из ЛТ при потере холестерина из липидных рафтов плазматической мембраны. Таким образом, используя вещества, оказывающие противоположные влияния на ЛТ, и действующие на разные классы нейтральных липидов, содержащихся в ЛТ, мы показали, что проточная цитометрия с использованием НК позволяет быстро, с большой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью регистрировать как накопление липидов в небольших по размеру ЛТ, так и уменьшение их уровня в живых клетках, не специализированных на создании жирового депо.
Ключевые слова: липидные тельца, проточная цитометрия, арахидоновая кислота, метил-в-цикло-декстрин, триацилглицерин, эфиры холестерина, эпителиальные клетки, мочевой пузырь лягушки
Б01: 10.7868/80233475513020047
В последнее время резко возрос интерес к исследованию липидных телец (ЛТ) — клеточных ор-ганелл, встречающихся практически во всех типах клеток. Структурно они представляют собой ядро из нейтральных липидов, главным образом триацилглицеринов (ТАГ) и эфиров холестерина (ЭХ), окруженное монослоем фосфолипидов (ФЛ). Согласно современным представлениям, у эукариот ЛТ образуются в эндоплазматическом ретикулуме: накопление нейтральных липидов между липид-
ными монослоями мембраны приводит к отщеплению липид-содержащей гранулы, окруженной липидным монослоем [1, 2]. Их размер может варьировать от 0.1 до 100 мкм в клетках белого жира.
Долгие годы ЛТ оставались практически без внимания, поскольку считалось, что они являются пассивными хранилищами жиров. Началом новой волны интереса к этим органеллам стало открытие специфических белков семейства РАТ (по первым буквам регШрт, ЛОЯР, Т1Р47), регу-
лирующих образование ЛТ в структурах эндо-плазматического ретикулума, слияние ЛТ, а также метаболизм содержащихся в них липидов [3—6]. Оказалось, что хранение энергетического запаса — не единственная задача ЛТ: они также являются запасом строительных блоков для мембран клетки, защищают клетку от интоксикации при избытке липидов и других липофильных веществ, участвуют в регуляции уровня биоактивных ли-пидов и играют центральную роль в клеточном метаболизме липидов [1, 7—10]. В гепатоцитах ЛТ являются местом локализации вируса гепатита С [11]. В клетках иммунной системы, наиболее хорошо изученных в отношении ЛТ, формирование ЛТ усиливается при действии патологических стимулов, что, как предполагают, связано с усиленной продукцией эйкозаноидов, предшественниками которых служит арахидоновая кислота, этерифицированная в ТАГ липидных телец [12, 13]. ЛТ содержат не только субстраты для синтеза эйкозаноидов, но и ферменты, обеспечивающие синтез или высвобождение этих регуляторов, — циклооксигеназу, липоксигеназу, фос-фолипазу А2 и сопряженные с ними протеинки-назы — МАР-киназы и PI-3-киназу [12, 14, 15].
Исследование ЛТ как динамических органелл, вовлеченных в широкий спектр процессов клеточного метаболизма и внутриклеточной сигнализации, требует адекватных методов их количественного анализа. Обычно используют красители, окрашивающие нейтральные жиры, — тетраоксид осмия, судан черный Б, масляный красный, нильский красный, BODIPY Число ЛТ подсчитывают на микрофотографиях или с помощью специальных программ определяют площадь пятен, окрашенных красителем, которую относят к числу клеток или ядер [16—18]. Однако такие методы, применяемые в основном к клеткам, обладающими крупными ЛТ очень трудоемки, не позволяют проводить массовые измерения и дают ограниченную информацию об исследуемой клеточной популяции. Использование проточной цитометрии для анализа липидных гранул, окрашенных флуоресцентными красителями, было предложено еще в 1985 г. [19]. Метод позволяет быстро и более точно анализировать флуоресценцию большого числа как живых, так и фиксированных клеток. Тем не менее проточная цитометрия нашла широкое применение, главным образом, в исследованиях клеток, содержащих крупные ЛТ, такие как адипоциты [20], макрофаги [21], а также дрожжи [22, 23] и одноклеточные водоросли [24], используемые в промышленных целях.
Данная работа посвящена использованию проточной цитометрии для количественного анализа изменения уровня липидов в ЛТ эпителиальных клеток, не специализированных на создании жировых депо и обладающих значительно более мелкими ЛТ. Из числа флуоресцентных красителей нами был выбран нильский красный (9-ди-
этиламино-5Н-бензо[а]феноксазин-5-один) (НК). В соединении с нейтральными липидами, такими как ТАГ и ЭХ, НК дает продукты, флуоресцирующие в желтой области спектра с максимумом при 580 нм, в соединении с ФЛ — в красной области с максимумом при 630 нм [25].
В качестве экспериментальных воздействий мы использовали арахидоновую кислоту (АК) и метил^-циклодекстрин (МßЦД), которые оказывают разнонаправленное действие на различные классы липидов (ТАГ и ЭХ соответственно), составляющих основу липидного ядра ЛТ. Известно, что экзогенная АК стимулирует формирование ЛТ в нейтрофилах [16, 26], тучных клетках [27], эозинофилах [12] и др. Показано, что АК усиливает образование ЛТ за счет увеличения синтеза ТАГ и его накопления в составе этих органелл [7, 26], хотя имеются данные о сигнальных рецептор-опосредованных эффектах АК на формирование ЛТ, не связанных с ее встраиванием в липиды ЛТ [17]. МßЦД, не проникающий в клетку акцептор холестерина, широко используемый для селективного извлечения холестерина из липидных рафтов плазматической мембраны [28], может оказывать противоположный эффект на формирование ЛТ, влияя на уровень содержащихся в них ЭХ. Известно, что ЭХ служат запасом холестерина и в случае его потери из плазматической мембраны могут использоваться для его восполнения [29, 30]. Для подтверждения эффектов, регистрируемых проточной цитометрией при экспериментальных воздействиях, мы анализировали количественное содержание липидных классов в клеточных экстрактах методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ТСХ) в сочетании с денситометрией.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на изолированных эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки Rana temporaria L. Животных содержали в лаборатории при температуре 5°С в емкостях, на 1— 1.5 см заполненных водой.
Выделение изолированных эпителиальных клеток. Внутреннюю полость у обездвиженной разрушением спинного мозга и вскрытой лягушки заполняли раствором "A", содержащим 85 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 17.5 мМ NaHCO3, 0.8 мМ KH2PO4, 2 мМ глюкозы, 2 мМ EDTA, 40 мкг/мл гентамицина (pH 7.5). Пузыри перевязывали, извлекали и помещали в раствор того же состава на 50 мин в условия интенсивной аэрации. К концу этого времени клетки спонтанно отделялись от стенок пузыря. Мукозные растворы фильтровали через четыре слоя газовой ткани и центрифугировали 10 мин при 100 g. Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в растворе "Б", содержащем 85 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 17.5 мМ NaHCO3, 0.8 мМ KH2PO4, 0.8 мМ MgCl2, 1.5 мМ CaCl2,
2 мМ глюкозы, 40 мкг/мл гентамицина, и снова центрифугировали при тех же условиях. Осадок ресуспендировали в модифицированной стерильной культуральной среде следующего состава: 1 часть среды L-15 (Leibovitz) (Sigma, США) + + 0.39 части Н2О с добавлением 40 мкг/мл гентамицина. Осмолярность среды соответствовала осмолярности плазмы крови лягушек и составляла 230 мОсм/кг воды. Подсчет количества клеток осуществляли в камере Горяева.
Инкубация клеток с АК и МßЦД. Клетки размещали в лунки 96-луночного культурального планшета (200 000 клеток в 150 мкл) и инкубировали с различными концентрациями АК или Mßü,B (Sigma, США) во влажной камере при температуре 23°С. Время инкубации составляло 1 ч для АК и 30 мин для MßЦД. АК растворяли в спирте, MßЦД — в растворе "Б". Контрольные пробы инкубировали в этих же условиях без добавок. В ряде экспериментов использовалась длительная инкубация с АК (до 24 ч). Для того, чтобы избежать эффекта раст
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.