ОБЗОР
581.1
ПРИМЕНЕНИЕ QTL-АНАЛИЗА В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
© 2007 г. Д. Вреугденхил*, М. Коорнэф**' ****, Л. И. Сергеева*' ***
* Лаборатория физиологии растений и ** Лаборатория генетики Вагенингенского Университета, Нидерланды *** Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва **** Макс Планк Институт селекции растений, Кельн, Германия Поступила в редакцию 21.06.2006 г.
Анализ локусов количественных признаков (QTL от quantitative trait locus) позволяет эффективно картировать и идентифицировать гены, определяющие сложные (полигенные) признаки. В обзоре обсуждаются основные принципы и последние достижения этого метода применительно к физиологическим исследованиям растений. В ближайшем будущем использованию метода QTL будут способствовать значительное расширение генетических ресурсов, совершенствование методов молекулярной биологии, геномики, протеомики и т.п. и быстрое накопление экспериментальных данных, полученных на модельных видах (арабидопсис) и культурных растениях.
Arabidopsis thaliana - QTL(s) - клонирование генов - функция генов - природная изменчивость
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 15-21
УДК
ВВЕДЕНИЕ
Последние десятилетия стали свидетелями значительных успехов в выяснении функции генов в растениях. Эти успехи отчасти определяются идентификацией генов, стоящих за конкретными мутантными фенотипами; в других случаях функции генов были установлены при анализе фенотипов мутантов, у которых нарушение функции одного гена не затрагивало фенотип в целом. Такие подходы получили название прямой и обратной генетики (соответственно, от фенотипа к гену и от гена к фенотипу). Оба подхода особенно эффективны при анализе признаков, обнаруживающих дискретную изменчивость, когда мутант и растение дикого типа различаются по одному гену (или нескольким генам при гибридном сочетании мутаций). Однако во многих случаях, например, при анализе скорости роста, непрерывная изменчивость признаков заставляет предполагать, что они контролируются многими
Сокращения: FLC - FLOWERING LOCUS C; FRI - FRIGIDA; HIF - гетерогенные инбредные семьи (от heterogeneous inbred families); LOD - критерий правдоподобия QTL (от logarithm of odds); NILs - близко изогенные линии (от near isogenic lines); RILs - рекомбинантные инбредные линии (от recombinant inbred lines); QTL(s) - локус(ы) количественных признаков (от quantitative trait locus(ci); Susy - сахарозосинта-за; сМ - сантиморганида; ФГМ - фосфоглюкомутаза. Адрес для корреспонденции: D. Vreugdenhil. Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University, Arboretumlaan 4, 6703 BD Wageningen, The Netherlands. Fax: 31-317-4847; e-mail: dick.vreugdenhil@wur.nl
генами или определяются взаимодействием гена с окружающей средой. Выяснение природы генов, контролирующих полигенные признаки, только начинается. В настоящем обзоре описаны сильные и слабые стороны метода анализа локусов количественных признаков (QTL от quantitative trait locus) применительно к этой задаче.
Приведенные примеры взяты по большей части из недавних исследований модельного растения Arabidopsis thaliana.
ЧТО ТАКОЕ АНАЛИЗ QTL
Этот анализ основан на природной внутривидовой аллельной изменчивости, которая приводит к небольшим или значительным количественным изменениям исследуемого признака. Природная аллельная изменчивость отличается от индуцированной изменчивости (у мутантов) тем, что аллели присутствуют в природных популяциях и, предположительно, в определенных условиях дают растениям селективные преимущества или, по меньшей мере, остаются нейтральными по отношению к отбору. Для картирования QTL нужна сегрегированная популяция, полученная путем скрещивания двух родительских форм. Желательно - но не обязательно, чтобы эти родительские формы различались по признаку, интересующему исследователя. Поскольку родительские линии происходят из природных популяций (образцы или экотипы дикорастущих видов и сорта, селекционные линии или расы культурных растений), они обычно различаются
Родительская линия 1
X
Родительская линия 2
F1
Рекомбинантные инбредные линии
Количественная характеристика признака
Рис. 1. Схема получения набора рекомбинантных линий (RILs) и их использования для QTL анализа. Для простоты в каждой линии показана только одна хромосома и представлены только шесть RILs. Скрещивали два экотипа растений (родительские линии 1 и 2, хромосомы которых выделены черным и серым цветом), и в поколении F1 проводили самоопыление, чтобы получить F2 линии. RILs получали многократным самоопылением F2 линий до гомозиготного состояния (поколение F8 или более выкий уровень гомозиготности). Черные и серые штриховые линии указывают положение и генотип молекулярных маркеров. В этом примере приведенные внизу количественные характеристики признака указывают на QTL в нижней части хромосомы; присутствие аллелей родительской формы 2 соответствует высокому уровню проявления признака, а аллели родительской формы 1 соответствуют низкому уровню проявления признака (цит. по [3] с разрешения автора).
10
12
13
5
5
4
по многим локусам. QTL-анализ устанавливает связь между количественным значением признака и аллельным составом локуса для всех индивидуальных растений в сегрегированной популяции. Сегодня генотипы индивидуальных растений (линий) легко определить с помощью молекулярных маркеров, QTL-анализ выявляет участки генома, где расположены гены или группы тесно сцепленных генов, обнаруживающих значительное количественное влияние на признак, и позволяет количественно оценить такое влияние. Отсюда следует, что QTL - это не ген, а только участок хромосомы, и для идентификации генов, ответственных за количественные изменения признака, связанного с данным QTL, необходимы дальнейшие исследования.
Эффективным инструментом для картирования QTL служат "бессмертные" картирующие популяции. После однократного генотипирования такие популяции можно многократно использовать для изучения одного и того же или различных признаков - или для изучения поведения данного признака в зависимости от условий внешней среды, когда выясняются эффекты взаимодействия генотип-внешняя среда. Чаще всего используют рекомбинантные инбредные линии (RILs от recombinant inbred lines) и инбредные или интрогрессивные линии, полученные с помощью
обратных скрещиваний. В случае арабидопсиса МЬ получают, скрещивая два контрастных экотипа и проводя повторное самоопыление и отбор потомства индивидуальных семян из Б2 поколения. В результате для арабидопсиса уже созданы коллекции ЫЬ, пригодные для анализа разнообразных признаков [1, 2]. Принцип картирования ОТЬ с помощью МЬ схематически показан на рис. 1 [3].
Точность картирования данного признака определяется тремя показателями: плотностью маркеров, размером популяции и точностью оценки количественного проявления признака, когда речь идет о физиологической изменчивости и точности измерения при определении наследуемости как доли изменчивости, обусловленной генетическими факторами. Чем больше популяция, тем больше число рекомбинационных событий и, соответственно, точность картирования. Число маркеров следует соразмерять с размерами популяции или, скорее, числом рекомбинаций. Увеличение числа маркеров до бесконечности не поможет при недостаточном числе рекомбинационных событий. Однако карта должна содержать достаточное число маркеров, чтобы точно выявить сайты рекомбинации. В случае арабидопсиса исследователи используют популяции ЫЬ, включающие от 30 до 420 и в среднем 100-150 линий.
ОТ QTL К ГЕНУ
В случае арабидопсиса клонирование генов, исходя из положения мутаций на генетической карте (позиционное клонирование), очень эффективно благодаря наличию многочисленных маркеров и легкости анализа сегрегированной популяции [4]. Сегодня для поиска генов-кандидатов достаточно картировать мутацию с точностью не менее 50 т.п.н., что в среднем соответствует расстоянию на карте в 0.2 сантиморганиды (сМ). Затем сравнение последовательностей генов-кандидатов у мутантов и растений дикого типа позволяет установить точное место мутации. Восстановление нормального фенотипа после трансформации мутантных растений аллелем дикого типа доказывает, что вызвавший мутацию ген был правильно идентифицирован. Тот же подход используют для картирования QTLs. Однако, поскольку позиционное клонирование предполагает последовательную идентификацию одного гена за другим, необходимо удостовериться в том, что в каждом случае анализу подвергается только один сегрегирующий локус. Для этого используют так называемые близко изогенные линии (NILs от near isogenic lines), в случае которых в геном рекуррентной родительской формы в положение QTL включено относительно небольшое число аллелей другого родителя. В дальнейшем NILs скрещивают с рекуррентным родителем, содержащим полиморфные маркеры на участке QTL, и из потомства отбирают популяцию NILs с различными рекомбинационными событиями. Для картирования QTL с высоким разрешением этот процесс повторяют с линиями из потомства, которые продолжают обнаруживать соответствующие QTL фенотипические различия. Те же операции используют для картирования мутации после того, как QTL удалось картировать с высоким разрешением в сравнительно небольшой участок хромосомы. Другой подход основан на использовании остаточной гетерози-готности RILs по данному QTL, которая сохраняется после нескольких циклов самоопыления. Генетическая основа потомства таких линий представлена материалом обеих родительских форм. Подобная концепция гетерогенных инбредных семей (HIF от heterogeneous inbred families) [5] эффективна, поскольку она не требует выделения и идентификации NILs, и очень удобна в тех случаях, когда фенотип не определяется одним единственным локусом одного из родителей (эпистаз). Для исследования индивидуальных генов достаточно отобрать линии, гомозиготные по одному локусу, но гетерозиготные по другому. Использование NILs и/или HIF также дает возможность подтвердить присутствие и эффект данного QTL.
Особые трудности связаны с анализом QTLs, которые слабо влияют на фенотип и сильно за
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.