УДК 577.352.465
ПРИМЕНЕНИЕ СИСТЕМЫ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЯ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЛИГАНДОВ ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В КУЛЬТУРЕ НЕЙРОНОВ
© 2013 г. А. В. Бережное, А. В. Кононов, Е. И. Федотова, В. П. Зинченко*
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3;
* электронная почта: vpz@mail.ru Поступила в редакцию 16.10.2012 г.
Предложен способ качественного и количественного анализа эффектов соединений, взаимодействующих с глутаматными ММБА-, АМРА-, и КА-рецепторами, с использованием неинвазивного метода микрофотометрии. Метод основан на регистрации активности лиганд- и потенциал-зависимых кальциевых каналов с применением двухволнового флуоресцентного зонда Бига-2. Подобраны условия, при которых повторное кратковременное (до 30 с) воздействие агонистов ММБА-, АМРА-и КА-рецепторов вызывает в большинстве клеток кальциевый ответ, практически идентичный первому, что дает возможность использовать реакцию клетки на первую аппликацию лиганда в качестве контроля. Последнее позволяет получать статистически репрезентативные кривые доза—ответ, усредненные по большой популяции клеток. С целью повышения чувствительности метода для каждого лиганда определен возраст культуры, оптимальный для проведения эксперимента. С целью сравнения результатов различных экспериментов и получения более точных значений констант активации и ингибирования введены определенные правила нормирования сигналов. Показано, что вариабельность кальциевых ответов однотипных индивидуальных нейронов на агонисты глутамат-ных рецепторов во многом обусловлена степенью и кинетикой их десенситизации. Для характеристики лигандов АМРА- и КА-рецепторов опыты проводили в присутствии ингибиторов десенситизации — циклотиазида и конканавалина А, соответственно, которые увеличивали амплитуду ответов и превращали импульсные ответы на агонисты в ступенчатые. Разработанный метод позволяет обнаружить в составе неизвестного образца лиганды исследуемых рецепторов, определить дозы полуактивации и полуингибирования, а также тип ингибирования. Метод сочетает высокую чувствительность, специфичность и производительность, обусловленную возможностью одновременного неинвазивного анализа индивидуальной активности сотен клеток. Методика применима как для получения характеристик, усредненных по всем исследуемым нейронам, так и для выбранных субпопуляций клеток и одиночных нейронов.
Ключевые слова: глутаматные рецепторы, ЕС50, антагонисты, десенситизация, концентрация кальция, нейроны гиппокампа, флуоресценция Бига-2.
Б01: 10.7868/8023347551303002Х
Флуоресцентный анализ одиночных клеток в культуре применяется уже многие годы для мониторинга активности различных молекулярных процессов и биохимических реакций в живых клетках. Измерение таких параметров, как концентрация ионов и мембранный потенциал стали рутинным методом клеточных исследований во многих лабораториях. Однако исследования в
Сокращения: ОУК1-52466 — селективный неконкурентный антагонист АМРА-рецепторов, FW — фторвиллардиин — селективный агонист АМРА-рецепторов, ВА — домоевая кислота — агонист КА-рецепторов, NBQX — конкурентный антагонист АМРА/КА-рецепторов, КА — каиновая кислота — агонист КА-рецепторов, СопА — конканавалин А. МК-801 — неконкурентный антагонист NMDA-рецепторов, В-АР5 — конкурентный антагонист NMDA-рецепторов.
этой области столкнулись с проблемой индивидуальности каждой клетки в культуре. Оказалось, что морфологически идентичные клетки в культуре по-разному отвечают на одно и то же воздействие и обладают различным количеством экс-прессированных в данный момент рецепторов, ионных каналов и других белков. Модуляция активности рецепторов и каналов системой внутриклеточной сигнализации также является причиной часто наблюдаемого несоответствия между константами диссоциации агонистов с рецепторами и полумаксимальной эффективной концентрацией (ЕС50), полученных из измерения концентрации кальция и других сопряженных
параметров, отражающих функциональную активность лиганда.
С другой стороны, в этом разнообразии удалось выявить определенные закономерности, позволяющие сгруппировать однотипные клетки в субпопуляции, отличающиеся функционально и по их физиологической роли в данной ткани. Наиболее яркий пример такого многообразия — нейроны головного мозга. В результате диффе-ренцировки в мозге появляются сотни различных типов нейронов [1], которые порой отличаются морфологически (десятки), но в большинстве случаев для идентификации нейрона необходимы комплексные исследования, в которых используются электрофизиологические методы, селективные антитела и системы анализа изображения. На сегодняшний день наиболее перспективными считаются системы анализа изображения, так как они позволяют одновременно регистрировать многие параметры активности у сотен нейронов. Один из таких параметров — концентрация Са2+ в цитозоле ([Са2+];). Количественные измерения [Са2+] с использованием двухволновых флуоресцентных зондов дают возможность создать на уровне одиночных клеток и клеточных популяций тест-системы для выявления и оценки эффективности соединений агонистов и антагонистов рецепторов.
В предыдущих работах мы описали методику выявления лигандов NMDA-, AMPA/KA-рецеп-торов с помощью кальций-чувствительных флуоресцентных зондов [2—6]. В настоящей работе представлено развитие этого подхода для количественной характеристики соединений, взаимодействующих с этими рецепторами. Метод основан на регистрации активности лиганд- и потенциал-зависимых кальциевых каналов с использованием двухволнового флуоресцентного зонда Fura-2 в культуре клеток гиппокампа крысы. Для каждого из рецепторов решали следующие задачи: выявление агониста, определение его специфичности и полумаксимальной эффективной концентрации (EC50); в случае антагониста — выявление, определение концентрации полумаксимального ингибирования (IC50), и типа ингибирования (конкурентный, неконкурентный, смешанный). При разработке метода использовали известные селективные лиганды исследуемых рецепторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. В работе использовали нейроба-зальную среду, добавку B-27, Fura-2AM, Hoechst 33342 (Invitrogen, США); домоевую кислоту, GYKI-52466, NBQX, фторвиллардиин (FW), AMPA, циклотиазид, АР-5, МК-801 (Tocris, Bioscience, Англия); ConA, PBS, NMDA (Sigma, США), среду Хенкса, эмбриональную сыворотку телят (MP Biomedicals, США). Культуру клеток гиппокампа
новорожденных крысят получали как описано ранее [7].
Измерения флуоресценции. Изменения [Ca2+] в нейронах оценивали по интенсивности флуоресценции двухволнового Са2+-чувствительного зонда Fura-2 [8, 9]. [Ca2+] измеряли с использованием системы анализа изображений на базе инвертированного моторизованного микроскопа Leica DMI6000 B, оснащенного высокоскоростной монохромной CCD-камерой HAMAMATSU C9100 и системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров Leica's Ultra-Fast Filter Wheels (время переключения 10—30 мс). Использовали объектив Leica HC PL APO 20x/0.7 IMM. В качестве источника возбуждения флуоресценции использовали осветитель Leica EL6000 с ртутной лампой высокого давления HBO 103 W/2. Для возбуждения и регистрации флуоресценции Fura-2 использовали набор светофильтров FU2 (Leica, ФРГ) с фильтрами возбуждения BP340/30 и BP387/15, светоделителем FT410 и фильтром эмиссии BP510/84. Полученные в двух различных каналах временные серии изображений обрабатывали в программе ImageJ с использованием плагинов Time Series Analyzer и RatioPlus. При обработке серий изображений измеряли амплитуду кальциевых ответов одиночных клеток, выраженную как отношение сигналов флуоресценции Fura-2 при возбуждении в 340 и 380 нМ. Для построения графиков и статистической обработки использовали Origin 8.0. Ошибка определения среднего при измерении амплитуд составляла 0.04 (здесь и далее данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение).
В качестве тест-системы использовали 7— 10-дневную культуру клеток гиппокампа крысы. Клетки гиппокампа выделяли из головного мозга новорожденных (2—4-дневных) крыс Spraque Dawley. Методика получения культуры клеток гиппокампа подробно изложена в [6]. Для измерения флуоресценции круглое покровное стекло диаметром 25 мм с культурой клеток, выращенных в чашках Петри и окрашенных зондом Fura-2AM, монтировали в специальную измерительную камеру. Объем среды в камере составлял 0.5 мл. Добавки реагентов производили полной сменой среды. В эксперименте измеряли ответ 120—140 нейронов, находящихся в поле зрения микроскопа. Для сравнения результатов опытов, проводимых в разные дни и на разных культурах, и для нормирования сигналов в схеме опыта предусмотрена стандартная деполяризующая добавка KCl постоянной концентрации. Основным измеряемым параметром была амплитуда кальциевого ответа (АКО) нейронов на кратковременную аппликацию агонистов ионотропных глутаматных рецепторов. Активацию каинатных (KA) рецепторов вызывали добавлением домоевой кислоты (DA) в присутствии селективного антагониста АМРА-рецепто-
Бига-
1.2 1.0 0. 0.6 0.4 0.2 0
2, 340/380
ЫМБЛ
5 10
,100
100 200 300 400 500 Время, с
АКО, норм.
1.0
0.8 - |
0.6 -
0.4 -
0.2 -
0 П 1
-6 -5 -4 МЛР-5](М)
Бига-2, 340/380
0.4 0.3 0.2 0.1 0
-7 -6 -5 -4 даМБЛКМ)
2 +
Рис. 1. Действие NMDA и конкурентного ингибитора NMDA-рецептора АР-5 на [Са ^ в нейронах гиппокампа. а - АР-5 дозозависимо подавляет кальциевый сигнал в нейронах, индуцированный 6 мкМ NMDA. На графике представлены усредненные ответы 128 клеток в эксперименте. Амплитуда ответа на 6 мкМ NMDA принята за 1. На кривых указаны концентрации добавленного АР-5 (мкМ). б - Зависимость амплитуды кальциевого ответа на 6 мкМ NMDA от концентрации АР-5, добавленного на фоне NMDA. Здесь и на рис. 2в, 3б, в, 4б, в, 5б, в каждая точка представлена средним значением, вычисленным по результатам 3-5 опытов. 1С50 = 2.67 ± 0.1 мкМ. в - Зависимость амплитуды кальциевого сигнала от концентрации NMDA в отсутствие антагониста (1) и в присутствии 2.7 мкМ AP5 (2). ЕС50 = 5.2 ± 0.6 мкM и 13 ± 1 мкM, коэффициент Хилла = 1.2 ± 0.1 и 1.3 ± 0.1 для (1)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.