БИОХИМИЯ, 2G15, том SD, вып. S, с. 1215 - 122S
УДК 577.218
ПРИРОДНАЯ ПИЩА ЛИЧИНОК ПЧЕЛ Apis mellifera ПО-РАЗНОМУ ВЛИЯЕТ НА ХАРАКТЕР ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В СОДЕРЖАНИИ 5-МЕТИЛЦИТОЗИНА В ДНК МАТОК ПО СРАВНЕНИЮ С РАБОЧИМИ ОСОБЯМИ И ТРУТНЯМИ*
© 2015 А. Страческа**, К. Ольшевски, М. Бьяда, Е. Деметраки-Палеолог
University of Life Sciences in Lublin, Department of Biological Basis of Animal Production, Faculty of Biology and Animal Breeding, Lublin 20-950, Poland; E-mail: aneta.strachecka@up.lublin.pl
Поступила в редакцию 01.12.14 После доработки 29.01.15
Одним из главных эпигенетических механизмов регуляции активации/ингибирования экспрессии генов является метилирование ДНК путем образования 5-метилцитозина. В представленной работе были определены иммуноферментным методом уровни общего метилирования ДНК у личинок, предкуколок, куколок и однодневных взрослых маток, рабочих особей и трутней пчел Apis mellifera. Процентное содержание 5-метилцитозина в ДНК личинок всех трех пчелиных каст было низким и одинаковым (~3—5%) вплоть до 4-го дня их развития после вылупления из яиц, однако у личинок трутней и рабочих особей содержание 5-метилцис-теина было несколько выше, чем у личинок маток. В целом характер возрастных изменений в уровнях метилирования ДНК различался у маток по сравнению с рабочими особями и трутнями: если у маток на разных стадиях морфогенеза эти уровни были повышены, то у двух других пчелиных каст — понижены. Процентное содержание 5-метилцистеина и весовое содержание метилированной ДНК в предкуколках и куколках маток составляли 15% (9,18 нг) и 21% (10,74 нг) соответственно, т.е. были существенно выше, чем у рабочих пчел и трутней тех же возрастов (2,5—4% (0,03—0,07 нг). Причем только у маток уровни метилирования были примерно вдвое ниже у имаго по сравнению с куколками 12% (6,78 нг) и 21% (10,74 нг) соответственно.) Эти наблюдения представляют несомненный интерес, в частности, для эмпирической геронтологии.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Apis mellifera, метилирование ДНК, эпигенетика, медоносная пчела, 5-метилцито-зин, онтогенез.
Регуляция экспрессии генов в ответ на изменения окружающей среды осуществляется на различных уровнях, в том числе путем эпигенетической модификации ДНК [1, 2]. Одним из эпигенетических механизмов подавления генной экспрессии является метилирование цито-зиновых азотистых оснований [3, 4]. Этот процесс осуществляется ДНК-метилтрансфераза-ми, а в качестве донора —СН3 групп выступает S-аденозил-Ь-метионин [5]. Многим организмам присуща фенотипическая пластичность, т.е. существование различных фенотипических форм, обладающих одним и тем же генотипом [6]. Личинки женских особей пчел Apis mellifera сохраняют полипотентность вплоть до 3-го дня после вылупления из яиц и могут превращаться
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-326, 22.02.2015.
** Адресат для корреспонденции.
как в маток, так и в рабочих пчел, поэтому 3-й и 4-й дни онтогенеза женских особей являются решающими с точки зрения выбора пути их дальнейшего развития. Для этого личинки будущих маток выкармливаются "королевской" пищей (маточным молочком), а личинки будущих рабочих пчел получают «рабочую» пищу, содержащую пыльцу [7—11]. Личинки будущих трутней развиваются из неоплодотворенных яиц, но также получают особое питание, отличное от пищи маток и рабочих особей. Возникает вопрос, может ли такое различие в естественной диете личинок, определяющее их дальнейший фенотип, сопровождаться эпигенетическими различиями в общих уровнях метилирования ДНК у маток, рабочих пчел и трутней?
Известно, что компоненты «королевской» пищи способны подавлять экспрессию метилтранс-фераз у личинок как на уровне генома, так и на посттрансляционном уровне, что приводит к снижению уровня метилирования гена, кодиру-
ющего динактин р62, и, в свою очередь, к повышению рождаемости маток и снижению рождаемости рабочих пчел или особей промежуточных каст [6, 11]. Личинки, воспитываемые как матки или рабочие пчелы, различаются по набору экспрессирующихся генов [12]. 4-4-Фенил-бутират, а также метаболит — фенилацетилглу-таминат, будучи добавленными в пищу личинок рабочих особей, стимулируют экспрессию многих генов, регулирующих развитие и продолжительность жизни пчел [13]. Вил ер и Робинсон [14] предположили, что добавление к пище пчел альтернативных источников углеводов (кукурузный сироп или сахароза) могло приводить к многочисленным различиям в экспрессии генов у взрослых рабочих особей. Эти изменения в экспрессии генов могли сказываться на метаболизме белков и процессах оксидоредукции, включая обмен ароматических аминокислот. Более того, наши предыдущие исследования позволяют предположить, что такие соединения как акарициды, кофеин, коэнзим р, а также промышленные выбросы в атмосферу влияли на метаболизм белков и антиоксидантов у пчел [15—20]. Помимо этого, нами было установлено, что уровни общего метилирования ДНК повышались по мере взросления пчел-имаго; добавление кофеина в пищу существенно снижало уровни метилирования ДНК у стареющих рабочих насекомых [17], а обработка амфотерици-ном В — приводила к стимуляции метилирования [15]. Все эти наблюдения позволяют предположить, что зависимые от окружающих условий изменения экспрессии различных генов в процессе жизненного цикла пчел могут быть связаны с изменением уровней метилирования их ДНК, и что это метилирование играет ключевую роль в развитии и продолжительности жизни насекомых.
Большинство исследований, касающихся уровней 5-метилтирозина в ДНК пчел, базировались на определении этого соединения в ДНК, изолированной из мозга взрослых насекомых [21]. В свою очередь активность ДНК-ме-тилтрансфераз как индикаторов интенсивности метилирования была определена у личинок и у имаго маток и рабочих пчел [11]. В представленном здесь исследовании мы применили комплексный подход и изучили уровни 5-метилцистеина у личинок на разных стадиях их развития, а также у предкуколок, куколок и молодых имаго разных пчелиных каст. Кушарски с соавт. [6] обнаружили, что интенсивность репликации ДНК была очень высокой у личинок 3—5-дневного возраста, что было обусловлено метилированием или деметилированием генных локусов-ми-шеней. Эти наблюдения свидетельствовали о
важности 3-5-дневного личиночного периода в онтогенезе женских особей пчел. Ши с соавт. [22] показали, что количество по-разному метилированных генов у 2-, 4- и 6-дневных личинок маток и рабочих пчел составляло 725, 3013 и 5049 соответственно. Многие из этих генов, принимающих участие в процессах развития, воспроизводства и регуляции метаболизма, слабее метилированы у личинок 4- и 6-дневных маток по сравнению с рабочими особями. В доступной литературе нет данных об уровнях общего метилирования ДНК на разных стадиях онтогенеза пчел. По этой причине в круг своего исследования мы включили 3- и 4-дневных личинок всех трех основных пчелиных каст: маток, рабочих особей и трутней. Помимо этого, мы исследовали предкуколки и куколки, поскольку существенные изменения в потреблении кислорода и производстве углекислого газа на этих стадиях метаморфоза могут быть связаны с изменением генной экспрессии. Кроме того, поскольку наблюдаются значительные различия в физиологии и поведении молодых имаго, то мы провели изучение особей различных каст и на этой стадии морфогенеза.
В этой работе проверены следующие гипотезы: 1) характер изменений в общем метилировании ДНК на отдельных стадиях развития пчел различается у маток, рабочих особей и трутней; 2) уровни общего метилирования ДНК повышаются в процессе онтогенеза пчел, как это происходит у других видов животных. Целью наших экспериментов явилось определение общего содержания 5-метилцистеина в ДНК маток, рабочих особей и трутней пчел Apis mellifera на разных стадиях их морфогенеза (включая личинок, предкуколок, куколок и молодых имаго). Проведенное нами исследование общего метилирования ДНК будет способствовать лучшему пониманию изменений в экспрессии генов в процессе онтогенеза особей различных пчелиных каст.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Биологический материал. Каждая из 10-ти пчелиных маток была искусственно осеменена семенем отдельного трутня и внесена в лишенную своей матки колонию пчел, размещенную в садках, состоящих из двух боксов (В1 + В2). Примерно через 1 мес и после начала откладки яиц матки из 5 колоний были изолированы в экранированные садки на три дня; каждый садок содержал по две рамки пустых сот (С1 и С2) для откладки яиц. Затем население каждой из этих пяти колоний было поделено на две равные
части и размещено в боксах В1 и В2. В каждый из пяти боксов В1 помещали по одной рамке с сотами С1 с яйцами и подсаживали маток для выведения из яиц рабочих особей. В боксы В2 помещали 1-дневных личинок, вылупившихся из яиц сот С2 и размещенных в 5-ти специальных пластиковых («Nicoplast», Франция) ячеистых маточных чашках; маток в эти боксы не подсаживали, чтобы выводились новые молодые матки. На 3-й и 4-й дни развития личинок и на стадии предкуколок (на 11-й день онтогенеза) отбирали по 20 образцов из сот С1, а также по 20 соответствующих образцов из маточных чашек каждого бокса В2. На 11-й день чашки из каждого бокса В2 помещали в инкубатор, а на 13-й (куколки) и 16-й дни (молодые матки-имаго) отбирали по 20 образцов из каждой чашки. По 20 аналогичных образцов (куколки и молодые рабочие-имаго) отбирали из сот С1 боксов В1 на 16-й и 21-й дни соответственно. Каждый отобранный образец помещали в пластиковую пробирку («Eppendorf», США) и хранили при —25° для дальнейшего анализа.
Оставшиеся пять маток обитали в пяти оставшихся колониях в садках, содержащих по одной рамке с пустыми сотами для выведения трутней (С3). На 3-й и 4-й дни развития личинок, на 14-й (предкуколки), 18-й (куколки) и 24-й дни (вышедшие молодые трутни) из каждой колонии отбирали по 20 образцов и замораживали их для дальнейшего анализа, как было указано выше.
Выделение ДНК и ее количественный и качественный анализ. Для экстракции ДНК использовали образцы цельных размороженных 3- и
4-дневных ли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.