РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2014, том 54, № 1, с. 38-49
МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ =
УДК [57+61]::539.1.04:577.123.383:34.49.47
ПРИРОДНЫЕ ПУРИНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ КАК РАДИОЗАЩИТНЫЕ СРЕДСТВА © 2014 г. Н. Р. Попова, С. В. Гудков, В. И. Брусков*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино
Пуриновые соединения — ксантозин, кофеин, инозин-5'-монофосфат и гуанозин-5'-монофосфат в диапазоне концентраций 0.02—1.0 ммоль/л проявляют антиоксидантные свойства in vitm, существенно уменьшая образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов, индуцированное рентгеновским излучением в водных растворах, и предотвращая образование 8-оксогуанина в ДНК. Исследуемые соединения нейтрализуют долгоживущие активные формы белков in vitro и проявляют выраженные радиозащитные свойства, увеличивая выживаемость мышей до 50% при внутри-брюшинном введении (45 мг/кг) после радиационного воздействия в летальной дозе 7 Гр. Исследуемые соединения при введении их как до, так и после облучения стимулируют процессы кроветворения, увеличивая количество лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови облученных животных в пострадиационный период, а также пострадиационное восстановление ДНК от повреждений. Перечисленные пуриновые соединения можно рассматривать как потенциально перспективные профилактические и терапевтические средства для уменьшения рисков патологического воздействия ионизирующего излучения на организм млекопитающих.
Ксантозин, кофеин, инозин-5'-монофосфат, гуанозин-5'-монофосфат, пуриновые соединения, активные формы кислорода, 8-оксогуанин, долгоживущие радикалы белков, окислительные повреждения ДНК, радиационно-индуцированная гибель.
DOI: 10.7868/S0869803114010135
Большинство известных в настоящее время радиомодифицирующих соединений проявляет защитные свойства при введении незадолго до воздействия радиации. В середине прошлого столетия было обнаружено, что препараты РНК [1, 2] защищали растения и животных от радиационно-индуцированных повреждений и увеличивали выживаемость облученных животных при введении их как до, так и после облучения. Гидролиза-ты РНК до уровня мононуклеотидов проявляли аналогичные защитные свойства [3]. Позднее было показано, что из всех основных природных ри-бонуклеозидов, входящих в состав РНК, только инозин и гуанозин обладают ярко выраженными антиоксидантными и радиозащитными свойствами. Причем наиболее эффективные радиозащитные свойства они проявляли при введении в организм вскоре после облучения [4, 5]. В связи с этим изучение радиозащитных свойств ряда природных пуриновых соединений, а также механизмов их действия, представленных в данной работе, актуально и связано с потенциальной возможностью использования полученных результатов в практических медицинских целях.
* Адресат для корреспонденции: 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН; тел.: (4967) 7394-97; факс: (4967) 33-05-53; e-mail: bruskov_vi@rambler.ru.
Исследованы антиоксидантные, радиопротекторные и радиотерапевтические свойства природных пуриновых соединений: ксантозина (Xao), кофеина (1,3,7-триметилксантин, Caf), инозин-5'-монофосфата (IMP) и гуанозин-5'-мо-нофосфата (GMP).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Животные. Экспериментальные исследования выполнены на 6-недельных самцах белых мышей аутбредной линий SHK. Животных массой 18— 22 г содержали в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН не более чем по 10 мышей в клетке. Работу с животными проводили согласно рекомендациям Комиссии по биоэтике ИТЭБ РАН.
Пуриновые соединения. В работе использовали Xao, Caf, IMP и GMP ("Sigma", США) в концентрациях 0.02; 0.05; 0.1; 1 ммоль/л в 1 ммоль/л фосфатном буфере с рН 7.4 для экспериментов in vitro и в концентрации 5 ммоль/л в 0.14 моль/л растворе NaCl для экспериментов in vivo. Мышам растворы пуриновых соединений вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 45 мг/кг.
Воздействие ионизирующего излучения. Облучение проводили на рентгеновской терапевтической установке "РУТ-15" ("Мосрентген", Россия). Животных и водные растворы облучали
при мощности дозы 1 Гр/мин (фокусное расстояние 37.5 см, сила тока 20 мА, напряжение 200 кВ), раствор ДНК с мощностью дозы 4.5 Гр/мин (фокусное расстояние 19.5 см, сила тока 20 мА, напряжение 200 кВ).
Определение концентрации перекиси водорода в водных растворах. Использовали высокочувствительный метод усиленной хемилюминесценции в системе люминол-4-йодофенол-пероксидаза хрена [6, 7]. Пуриновые соединения (0.02— 1.0ммоль/л) прибавляли в раствор непосредственно перед облучением. Регистрацию величины хемилюминесценции осуществляли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика "Бета-1" (СССР), работающего в режиме счета одиночных фотонов.
Определение продукции гидроксильных радикалов. Определение концентрации гидроксильных радикалов осуществляли с помощью их реакции с кумарин-3-карбоновой кислотой (ККК), продукт гидроксилирования которой — 7-ОН-ККК — является удобным флуоресцентным зондом для определения образования этих радикалов [6]. Пуриновые соединения (0.02—1.0 ммоль/л) добавляли в раствор ККК непосредственно перед облучением. Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре SFM 25А (Италия) при ^ех = 400 нм, ^ет = 450 нм в зеркальной кварцевой кювете при комнатной температуре [7].
Иммуноферментный анализ по определению содержания 8-оксогуанина в ДНК. Для количественного определения 8-оксогуанина (7,8-дигидро-8-оксогуанина, 8-ОГ) в ДНК использовали метод иммуноферментного анализа с применением мо-ноклональных антител, спе-цифичных к 8-ОГ. Экспериментальные процедуры подробно описаны ранее [8].
Микроядерный тест. Количество цитогенети-ческих повреждений в клетках костного мозга мышей определяли по процентному содержанию полихроматофильных эритроцитов с микроядрами (ПХЭ с МЯ). Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 28 ч после облучения. Гистологические препараты готовили и окрашивали по стандартной методике с модификациями, связанными с растворением клеточного материала. Подсчет ПХЭ с МЯ осуществляли с помощью светового микроскопа с иммерсионным объективом при увеличении х1000 [5].
Тест на выживаемость. Выживаемость мышей после воздействия рентгеновского излучения определяли ежедневно в течение 30 сут. Пурино-вые соединения (5 ммоль/л) вводили внутрибрю-шинно мышам по 0.5 мл за 15 мин до облучения или через 15 мин, 3, 5 или 8 ч после облучения. Контролем служили две группы мышей — облученные в той же дозе или не подвергавшиеся об-
лучению, которым инъецировали изотонический раствор NaCl.
Подсчет форменных элементов крови. В группе из 10 животных у пяти, отобранных случайным образом, подсчитывали количество форменных элементов периферической крови, а затем эти результаты были усреднены. В конце эксперимента, если число выживших мышей в группе было меньше пяти, кровь для подсчета забирали у всех оставшихся животных. Образцы периферической крови брали из хвостовой вены. Все экспериментальные процедуры подробно описаны ранее [5].
Измерение индуцированной рентгеновским излучением хемилюминесценции белковых растворов. Данный метод позволяет определить количество образующийся в растворе долгоживущих активных (в смысле наличия радикалов) форм белка. Измерение индуцированной хемилюминесцен-ции раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) проводили с помощью хемилюминометра "Биотокс7А-М" (Россия). БСА (0.1%) растворяли в 20 ммоль/л Трис-HCl буфере, рН 8.0. Пуриновые соединения добавляли к раствору белка через 1 ч после облучения в конечной концентрации 0.1 ммоль/л.
Статистический анализ. Средние значение и величина стандартной ошибки были рассчитаны для большинства результатов. Средние значения в экспериментальных группах сравнивали с выявленными в контрольной группе, используя " U" критерий теста Манна—Уитни или непарный i-критерий Стьюдента. В экспериментах на выживание различия между группами сравнивали по точному критерию Фишера. При р < 0.05 разница считалась статистически значимой.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенных исследований установлено, что Xao, Caf, IMP и GMP в диапазоне концентраций 0.02—1.0 ммоль/л проявляют существенные антиоксидантные свойства, уменьшая радиационно-химический выход перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах и образование 8-ОГ в растворах ДНК под действием рентгеновского излучения in vitro (табл. 1). Антиоксидантные свойства исследуемых пуриновых соединений убывают с уменьшением концентрации этих соединений. В концентрациях 0.1 и 1 ммоль/л Xao, Caf, IMP и GMP в существенной мере сходно изменяют радиацион-но-химические выходы перекиси водорода и гидроксильных радикалов, так, в концентрации 0.1 ммоль/л радиационно-химические выходы в среднем всего лишь на 20—30% выше по сравнению с наблюдаемыми при концентрации 1 ммоль/л. Антиоксидантные свойства исследуемых соединений вероятно обусловлены их низки-
Таблица 1. Влияние Xao, Caf, IMP и GMP на образование гидроксильных радикалов, перекиси водорода в фосфатном буфере и 8-оксогуанина в ДНК индуцированных рентгеновским излучением в дозе 7 Гр
Воздействие OH-радикалы, мкмоль/л ФУД H2O2, мкмоль/л ФУД 8-ОГ на 105 гуанинов в ДНК ФУД
7 Гр 1.78 ± 0.03 - 0.59 ± 0.02 - 5.5 ± 0.2 -
Концентрация веществ 0.02 ммоль/л
7 Гр + Xao 7 Гр + Caf 7 Гр + IMP 7 Гр + GMP 1.62 ± 0.04 1.68 ± 0.04 1.61 ± 0.06 1.67 ± 0.03 1.1 1.0 1.1 1.1 0.38 ± 0.02* 0.56 ± 0.03 0.50 ± 0.01* 0.45 ± 0.03* 1.6 1.1 1.2 1.3 4.5 ± 0.3* 3.3 ± 0.1* 3.3 ± 0.6* 4.1 ± 0.3* 1.2 1.7 1.7 1.3
Концентрация веществ 0.1 ммоль/л
7 Гр + Xao 7 Гр + Caf 7 Гр + IMP 7 Гр + GMP 1.36 ± 0.02* 1.10 ± 0.04* 1.30 ± 0.05* 1.32 ± 0.04* 1.3 1.6 1.4 1.3 0.26 ± 0.02* 0.40 ± 0.01* 0.38 ± 0.01* 0.28 ± 0.02* 2.3 1.5 1.6 2.1 2.6 ± 0.2* 1.2 ± 0.3* 2.6 ± 0.4* 3.0 ± 0.2* 2.1 4.6 2.1 1.8
Концентрация веществ 1 ммоль/л
7 Гр + Xao 7 Гр + Caf 7 Гр + IMP 7 Гр + GMP 0.61 ± 0.05* 0.37 ± 0.03* 0.57 ± 0.06* 0.59 ± 0.04* 2.9 4.8 3.1 3.0 0.15 ± 0.01* 0.33 ± 0.01* 0.25 ± 0.01* 0.21 ± 0.01* 3.9 1.8 2.4 2.8 2.1 ± 0.1* 0.7 ± 0.4* 1.9 ± 0.2* 2.6 ± 0.1* 2.6 7.8 2.9 2.1
Примечание. Данные представлены как среднее зна
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.