ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 2, с. 189-192
УДК 579.22,581.1
ПРОБИОТИКИ ДЛЯ РАСТЕНИЙ: NO-ПРОДУЦИРУЮЩИЕ ЛАКТОБАЦИЛЛЫ ЗАЩИЩАЮТ РАСТЕНИЯ ОТ ЗАСУХИ
© 2014 г. Д. Р. Яруллина, Е. В. Асафова, Ю. Е. Картунова, Г. К. Зиятдинова, О. Н. Ильинская
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань 420008 e-mail: kasfes@gmail.com Поступила в редакцию 4.06.2013 г.
После инокуляции корней пшеницы суспензией бактерий Lactobacillus plantarum в листьях обнаружено нивелирование окислительного стресса, регистрируемого по накоплению Н2О2 и малонового диальдегида. При определении вклада бактериального NO в развитие стресс-реакции растений выявлены активация каталазы и повышение интегральной антиоксидантной емкости в проростках, обработанных лактобациллами с индуцированным синтезом NO. Таким образом, впервые показано, что лактобациллы оказывают влияние на защитно-приспособительные реакции растений при стрессе, в том числе при участии оксида азота.
DOI: 10.7868/S0555109914020196
Оксид азота (NO) играет важную роль в защитных реакциях растений на стресс, вызванный абиотическими факторами, в частности обезвоживанием [1, 2]. Абиотические стрессоры нарушают внутриклеточный редокс-гомеостаз, что ведет к образованию активных форм кислорода (АФК) и развитию окислительного стресса [3]. При этом в растениях увеличивается синтез оксида азота, который связывает АФК и таким образом снижает последствия окислительного стресса. Кроме того, NO способен регулировать экспрессию генов стресс-ответа, прежде всего антиоксидантных ферментов [2]. В связи со стресс-лимитирующей ролью NO, экзогенные доноры оксида азота, например нитропруссид натрия, применяются в качестве элиситоров для повышения устойчивости растений к засухе [4, 5].
Микроорганизмы прикорневой зоны растений (ризосферы) также оказывают на растения протекторное действие, механизмы которого могут быть различны. Стимулирующие рост растений ризобактерии (plant growth-promoting rhizo-bacteria, или PGPR) способствуют более высокой устойчивости растений к засухе за счет активности 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) дезаминазы, снижающей в растениях уровень "стрессового" этилена [6]. Бактерии Paenibacillus polymyxa активируют в растениях Arabidopsis thaliana экспрессию генов стресс-ответа ERD15 и RAB18 [7]. У ряда микроорганизмов обнаружена способность образовывать фитогормоны, аналогичные тем, которые регулируют устойчивость растений к воздействию неблагоприятных факторов среды: ауксины (например, индолил-3-уксус-ную кислоту), абсцизовую кислоту, цитокинины
и гиббереллины [8]. Индуцированная стресс-устойчивость растений может быть опосредована такими свойствами PGPR, как способность фиксировать молекулярный азот атмосферы, трансформировать труднорастворимые соединения почвы, прежде всего минеральные фосфаты, изменять проницаемость мембран клеток корневых тканей, тем самым увеличивая поглотительную способность корней растений, и др. [6].
Известно, что бактериальный NO легко преодолевает межклеточные барьеры и вовлечен в симбиотические отношения растений и ризо-сферных микроорганизмов: так, оксид азота, синтезируемый Azospirillum brasilense, индуцирует образование латеральных корней у томата [9, 10]. В настоящей работе впервые продемонстрировано влияние бактериального оксида азота на вызванный обезвоживанием окислительный стресс в растениях пшеницы. Поскольку в качестве биогенного источника NO выбраны бактерии Lactobacillus plantarum 8Р-А3, полученные результаты открывают потенциальную возможность применения пробиотических лактобацилл в растениеводстве в виде бактериальных препаратов.
Цель работы — выяснение влияния L. plantarum 8Р-А3 как источника NO на особенности протекания окислительного стресса в растениях пшеницы при обезвоживании.
МЕТОДИКА
Растения яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Дебют выращивали при 23 ± 2°C, освещенности 10 клюкс и 12-часовом фотопериоде в течение 7 сут в кюветах на водопроводной воде. Для
(a)
(б)
Ф 3
л 2
о ^
50
40
б30
S 20
л 10
Изменение содержания пероксида водорода (а), малонового диальдегида (б), уровня интегральной антиоксидантной емкости (в) и активности каталазы (г) в листьях яровой пшеницы под влиянием обезвоживания. 1 — растения, в которых был индуцирован стресс обезвоживания (3 ч, 26—28°C), 2 — контрольные растения, не подверженные стрессу обезвоживания. I — корни растений предварительно выдерживали 2 ч в дистиллированной воде; II — то же в суспензии бактерий Lactobacillusplantarum 8Р-А3 плотностью 109 кл./мл в 0.9%-ном растворе NaCl, III — то же в суспензии бактерий, в которых синтез NO был активирован L-аргинином.
обработки растений в качестве донора NO использовали бактерии L. plantarum 8Р-А3, выделенные из препарата "Лактобактерин сухой" (ФГУП "Пермское НПО "Биомед"). Бактерии выращивали в пробирках объемом 50 мл, содержащих 30 мл среды DeMan-Rogosa-Sharpe (MRS), в течение 24 ч. Для активации биосинтеза NO в среду культивирования лактобацилл добавляли 100 мкМ L-аргинин. По истечении времени инкубации клетки осаждали центрифугированием, трижды отмывали от питательной среды 0.9%-ным раствором NaCl и ресуспендировали в том же растворе до конечной плотности 109 кл./мл [11]. Корни проростков помещали на 2 ч в суспензию лакто-бацилл или в дистиллированную воду. Для индукции стресса обезвоживания отсеченные листья пшеницы подсушивали в световой камере "Био-трон-3" (Россия) при t = 26—28°C и постоянном освещении 10 клюкс в течение 3 ч. Навеску листьев 0.2 г растирали со средой для гомогенизации, содержащей 50 мМ трис-НС1-буфер, рН 7.8, 1 мМ аскорбата, 1 мМ ЭДТА, 10%-ный сорбит. Го-могенат центрифугировали 15 мин при 13000 об/мин и 5°С. Интегральную антиокси-дантную емкость (АОЕ) супернатанта (далее растительного экстракта) определяли методом куло-нометрического титрования электрогенериро-
ванным бромом [12]. Активность каталазы в супернатанте оценивали по снижению поглощения при 240 нм, вызванному разложением H2O2, и выражали в мкмоль восстановленного H2O2 (s = 39.4 мМ-1 см-1) за 1 мин на мг белка. В качестве индикаторов окислительного стресса использовали H2O2 и стабильный продукт перекис-ного окисления липидов малоновый диальдегид (МДА). Количество МДА в растительных тканях определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой и рассчитывали с учетом коэффициента экстинкции s = 155 мМ-1 см-1, выражая в мкмоль/г сырой массы [13]. Содержание H2O2 в листьях определяли с помощью красителя Xylenol Orange ("Sigma", США) и выражали в мкмоль/г сырой массы [14]. Статистическую обработку результатов проводили в программе "Microsoft Excel".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящей работе предпринята попытка предотвратить развитие окислительного стресса в проростках пшеницы при обезвоживании, воздействуя на их корни суспензией бактерий L. plantarum 8Р-А3. Лактобациллы этого вида наиболее часто обнаруживаются на растениях [15], однако их значение для макросимбионта неизвестно. Ра-
4
1
0
0
ПРОБИОТИКИ ДЛЯ РАСТЕНИЙ: NO-ПРОДУЦИРУЮЩИЕ ЛАКТОБАЦИЛЛЫ
191
нее нами было показано, что данные микроорганизмы способны образовывать N0, причем при добавлении субстрата N0-синтазы аминокислоты Ь-аргинина, в соответствии с "парадоксом Ь-аргинина", продукция N0 увеличивалась более чем в 2 раза [11]. Результаты данной работы впервые показали, что, аналогично N0 растительных клеток, оксид азота бактериального происхождения оказывает стресс-лимитирующее действие на растения, в связи с чем его продуценты — лакто-бактерии Ь. р1аШатт 8Р-А3 можно рассматривать как перспективный бактериальный препарат для сельского хозяйства.
Инокуляция проростков пшеницы суспензией лактобацилл не влияла на содержание в них Н2О2 и МДА, а также на активность каталазы, но приводила к снижению интегральной АОЕ на 21— 25% по сравнению с растениями, не обработанными бактериями (рисунок, а—г, 1). Наши данные согласуются с недавно опубликованными результатами, демонстрирующими снижение активности антиоксидантных ферментов у кукурузы [16] и ячменя [17] после обработки микроорганизмами группы РОРЯ. По-видимому, данный эффект можно считать универсальным для растений, которые вследствие инокуляции РОРЯ менее подвержены действию стресс-факторов и, соответственно, системы антиоксидантной защиты в них не индуцированы, в отличие от необработанных бактериями растений.
Обезвоживание приводило к увеличению содержания Н2О2 и МДА (рисунок а, б, I) в клетках необработанных бактериями растений, что отражает естественный процесс развития окислительного стресса в растениях при засухе [3]. АОЕ растительных экстрактов при этом закономерно снижалась, а активность каталазы существенно не изменялась (рисунок в, г, I). Мы впервые показали, что обработка таких растений лактобацил-лами снимала окислительный стресс: уровень Н2О2 и МДА в обработанных лактобациллами и подверженных высушиванию проростках не отличался от такового в интактных, не подвергшихся высушиванию растениях (рисунок а, б, II, III). Выявленный эффект подтверждает концепцию "эффективных микроорганизмов", разработанную Т. Хига и постулирующую положительную роль молочнокислых бактерий для растений [18]. Лактобациллы эффективны против биотических стрессоров благодаря своей высокой антагонистической активности в отношении растительных патогенов [19]. Участие активных метаболитов лактобацилл в реакции растений на окислительный стресс показано нами впервые. Одним из факторов стресс-лимитирующей активности лактобацилл определенно является N0, который снижал уровень опасных последствий обезвоживания, что зарегистрировано нами по увеличе-
нию суммарной АОЕ (рисунок в) и активности каталазы (рисунок г). Важно отметить, что в растениях, подвергшихся обработке суспензией лак-тобацилл с базальным уровнем биосинтеза N0, при обезвоживании активность каталазы и уровень АОЕ не отличались от таковых контрольных растений, не подвергшихся высушиванию (рисунок в, г, II). Напротив, в проростках пшеницы, прединку-бированных в суспензии лактобацилл с повышенным синтезом N0, величина этих параметров была значительно повышена (рисунок в,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.